نوع مقاله : مقاله ترویجی
نویسندگان
پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
چکیده
RNA پیامرسان (mRNA) پتانسیل گسترده ای برای استفاده در سیستم های بیولوژیکی دارد. با این حال ، یک محدودیت اساسی در استفاده از آن ، نیمه عمر نسبتاً کوتاه آن در سیستم های بیولوژیکی است. در اینجا ما RNA حلقوی (circRNA) اگزوژنی (با منشا خارجی) را توسعه دادیم تا مدت زمان بیان پروتئین از RNA یی با طول کامل را، افزایش دهیم. نخست ، ما یک اینترون خود پیرایشگر (self-splicing intron) را طوری طراحی کردیم تا به وسیله یک طراحی منطقی (rationally designing) به کمک توالی های موجود که به نحو موثری اسپلایسینگ کمک میکنند ، در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، دامنه گسترده ای از توالی های با طول تا 5kb را، حلقوی سازد. در ادامه ترجمه پروتئین کاربردی از این circRNAها را در سلولهای یوکاریوتیک به حداکثر می رسانیم و در خواهیم یافت که circRNAهای مهندسی شده که به وسیله کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا تخلیص شدهاند کیفیت بالای تولید پروتئین را از نظر مقدار پروتئین تولید شده وهمچنین پایداری تولید پروتئین، ارائه می دهند. این یکی اولین مطالعاتی است که از circRNA اگزوژن برای بیان قوی و پایدار پروتئین در سلولهای یوکاریوتی استفاده کرده است و نشان داده که circRNA، جایگزین مناسب برای mRNA های خطی میباشد.
کلیدواژهها
Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells.
Wesselhoeft R. Alexander et al.
Nature communications (2018) 9:2629
مهندسی RNA حلقوی به منظور ترجمه قوی و پایدار در سلولهای یوکاریوتی
ارد قویمی و سعید امین زاده*
تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پزوهشکده زیست فناوری صنعت و محیط زیست، گروه مهندسی زیست فرایند
چکیده
RNA پیک (mRNA) پتانسیل گسترده ای برای استفاده در سیستم های بیولوژیکی دارد. با این حال، یک محدودیت اساسی در استفاده از آن، نیمه عمر نسبتاً کوتاه آن در این سیستمها است. در اینجا ما RNA حلقوی (circRNA) اگزوژنی (با منشا خارجی) را توسعه دادیم تا مدت زمان بیان پروتئین از RNA یی با طول کامل را، افزایش دهیم. نخست، ما یک اینترون خود پیرایشگر (self-splicing intron) را طوری طراحی کردیم تا به وسیله یک طراحی منطقی (rationally designing) به کمک توالی های موجود که به نحو موثری اسپلایسینگ کمک میکنند، در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)، دامنه گسترده ای از توالی های با طول تا 5kb را، حلقوی سازد. در ادامه ترجمه پروتئین کاربردی از این circRNAها را در سلولهای یوکاریوتیک به حداکثر می رسانیم و در خواهیم یافت که circRNAهای مهندسی شده که به وسیله کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (high performance liquid chromatography) تخلیص شدهاند کیفیت بالای تولید پروتئین را از نظر مقدار پروتئین تولید شده وهمچنین پایداری تولید پروتئین، فراهم میکنند. این یکی اولین مطالعاتی است که از circRNA اگزوژن برای بیان قوی و پایدار پروتئین در سلولهای یوکاریوتی استفاده کرده است و نشان داده که circRNA، جایگزین مناسب (و امید بخشی ) برای mRNA های خطی میباشد.
کلیدواژگان: RNA حلقوی، ترجمه قوی و پایدار، سلولهای یوکاریوتی
* مترجم مسئول، پست الکترونیکی: aminzade@nigeb.ac.ir
اخیراً RNA های حلقوی (circRNAها) اندوژن متعلق به سلول های یوکاریوتی به دلیل شیوع و دامنه گسترده عملکردهای بالقوه بیولوژیکی، توجه بیشتری را به خود جلب کرده اند (1). اکثر circRNAهایی که طبیعت یافت میشوند از طریق پیرایش برگشتی[1] تولید میشوند (2، 3 و4) و به نظر میرسد به عنوان RNAهای غیررمزگذار عمل میکنند(1, 5, 6). با این حال، نشان داده شده است که برخی از circRNAهای درونزاد دروزوفیلا و انسان رمز پروتئین هستند (7 و 8). cricRNAهای درونزاد، علاوه بر داشتن توانایی بالقوه رمزگذاری پروتئینها، فاقد انتهاهای آزاد مورد نیاز برای تخریب وابسته به اگزونوکلئاز هستند. این امر cricRNAها را در برابر مکانیسمهای تجزیه RNA مقاوم میکند و در مقایسه با mRNAهای خطی همتای آنها، عمر آنها را طولانیتر میکند (2 و 9). به همین دلیل است که حلقوی شدن ممکن است پایداری mRNAهایی را که عموماً از نیمه عمر کوتاه آسیب میبینند، فراهم سازد (10 و 11) و بنابراین حلقوی کردن mRNA ممکن است کارایی کلی mRNA های برونزاد (اگزوژن) را برای کاربردهای مختلف بهبود بخشد (12).
تلاشهای قبلی برای افزایش پایداری mRNA شامل استفاده از: مناطق غیرقابل ترجمه(UTR) مانند نواحی موجود در mRNA بتا گلوبین طبیعی، آنالوگهای کلاهک (cap) متیل گوانوزینه برای محافظت از mRNA در برابر تجزیه کلاهک توسط دِکپینگ آنزیمها[2]، مدیفیکیشن یا اصلاح نوکلئوزید ها و بهینه سازی کدون میباشد. این استراتژی ها پیشرفت اندکی در پایداری RNA به همراه داشتهاند (10, 13-16) لذا رویکردهای جایگزین مثل حلقوی کردن RNA برا تثبیت پایداری آن مطلوب است. با این حال، حلقوی شدن کارآمد RNA طویل "رونویسی شده در شرایط In vitro [3]"(IVT)، تخلیص circRNA ، و بیان کافی پروتئین از circRNA موانع مهمی در این پروسه هستند که باید بر طرف شوند. در این مطالعه، ما یک رویکرد مهندسی برای تولید circRNAهای برونزاد ارائه کردیم تا بیان پروتئین در سلولهای یوکاریوتی به صورت قوی و پایدار صورت پذیرد.
نتایج
حلقوی سازی RNA طویل به کمک هومولوژی. سه استراتژی کلی برای حلقوی شدن RNA برونزاد وجود دارد: 1. روشهای شیمیایی با استفاده از بروماید سیانوژن یا یک عامل متراکم کننده، 2. روش های آنزیمی مبتنی بر RNA و DNA لیگاز ها، و 3. روش های ریبوزیماتیک با استفاده از خودپیرایشی اینترونها (17-19). یک روش ریبوزیماتیک که از اینترونهای کاتالیتیک گروه I پس و پیش شده[4] استفاده میکند گزارش شده که بیشتر برای حلقوی سازی RNAهای طولانی مناسب است و فقط به افزودن GTP و Mg2+ به عنوان کوفاکتور نیاز دارد(17). این استراتژی اسپلاسینگ پس و پیش شدن اینترون-اگزون (PIE[5])شامل احاطه شدن ترکیبی از بخشی از اگزون های دو طرف، توسط توالی نیمه های اینترون میباشد(به عبارتی در این استراتژی جایگاه اینترون و اگزون جابه جا میشود-مترجم)(20). در شرایط آزمایشگاهی، این ساختارها متحمل دو واکنش ترنس استریفیکیشن میشوند که مشخصه اینترونهای کاتالیتیک گروه 1 هستند؛ اما از آنجا که حالا اگزون ها (در مرکز دو اینترون) ادغام شدهاند، با اتصال '5 به '3 به صورت حلقه، برش خورده و جدا میشوند(17) (شکل 1.a). ما با استفاده از این استراتژی به عنوان نقطه شروع برای ایجاد RNA حلقوی رمزگذار پروتئین، یک توالی 1.1 کیلوبازی شامل تمام طولIRES[6] (جایگاه میانی یا درونی ورود ریبوزوم) یک ویروس انسفالومیوکاردیت[7] (EMCV)، یک پیام (یا توالی) گائسیا لوسیفراز[8] (GLuc)، و دو ناحیه کوتاه مربوط به 2 قطعه اگزون (قطعات اگزون 1 و اگزون 2) ساختار PIE را بین اینترونهای '3 و '5 از اینترونهای کاتالیتیک گروه I پس و پیش شده[9] مربوط به ژن تیمیدیلات سنتاز[10] (Td) فاژ T4 وارد کردیم(21) (شکل 1.a و داده های تکمیلی 1).
RNA پیشساز با رونویسی به روش run-off سنتز شد و سپس در حضور یونهای منیزیم و GTP برای شروع حلقوی سازی حرارت داده شد، این عمل همانطور که پیشتر برای حلقوی سازی RNAهای کوتاهتر استفاده شده بود، برای این واکنش نیز ضروری است(21). با این حال با این روش موفق نشدیم محصولات پیرایش شده را به دست آوریم. ما حدس میزنیم این امر به علت مداخله نواحی طولانی بین جایگاههای پیرایش است، ممکن است این نواحی طولانی بینابینی توانایی جایگاههای پیرایش را در تعامل با یکدیگر کاهش داده و امکان تشکیل یک مجموعه پایدار را پایین آورد و در نتیجه باعث کاهش کارایی فرآیند پیرایش شود. در واقع، در حالت طبیعی ناحیه مداخلهگر بین جایگاههای پیرایش '3 و '5 (ناحیه اینترونی طبیعی) از اینترونهای گروه I به طور متوسط 300-500 نوکلئوتید طول دارد(22)، در حالی که ناحیه (بینابینی یا) مداخلهگر فعلی در RNA مهندسی شده که ساختیم، دو تا چهار برابر بیشتر طول دارد. بنابراین ما بازوهای هومولوگ[11] به طول 9 (ضعیف) و 19 (قوی) نوکلئوتید طراحی کردیم که در ناحیه ناحیه '3 و '5 RNA پیشساز مکمل بودند تا بتوانند جایگاههای پیرایش '3 و '5 را به هم نزدیک کنند (شکل 1b.، اطلاعات تکمیلی 1). افزودن این بازوهای مکمل باعث افزایش کارایی فرآیند پیرایش از 0 به 16٪ برای بازوهای با هومولوژی ضعیف و 48٪ برای بازوهای با هومولوژی قوی شد که با ناپدید شدن باند RNA پیشساز ارزیابی می شود (شکل 1.c). برای اطمینان از اینکه محصول اصلی پیرایش شدۀ حلقوی شده است، ما واکنش اسپلایسینگ را با RNase R تیمار کردیم(شکل 1.d، اطلاعات تکمیلی شکل 1.a). محصول واکنش پیرایشی تیمار شده با Rnase R در محل تقاطع جایگاه پیرایشی توالی یابی شده و اگزونهای متصل شده را نشان میدهد، همچنین واکنش پیرایشی تیمار شده با RNaseR به همراه RNase H هدایت شده، یک تک باند را تولید کرد که بر خلاف دو باند حاصل از هضم RNA پیشساز خطی هضم شده با RnaseH به تنهایی بود (شکل 1.d و e، اطلاعات تکمیلی شکل 1.a). این داده ها نشان می دهد که circRNAها محصول اصلی این واکنشهای اسپلایسینگ هستند و اینکه الکتروفورز ژل آگارز امکان جداسازی ساده و مؤثر محصولات اسپلایسنگ حلقوی از مولکول های پیش ساز خطی، حلقه های شکسته(برش خورده)، حد واسط های پیرایشی و اینترون های جدا شده را فراهم می آورد.
شکل 1 - پیرایش اینترون-اگزون پس و پیش شده و افزودن بازوهای دارای هومولوژی. a شکل شماتیک طراحی ساختار PIE (permuted intron-exon) و مکانیسم پیرایش. اینترون کاتالیتیک گروه I از ژن Td فاژ T4 به گونه ای جدا شده است تا عناصر ساختاری ضروری برای تابخوردگی ریبوزیم را حفظ کند. قطعه اگزون 2 به بالادست قطعه اگزون 1 متصل شده است، و یک ناحیه کدینگ به طول تقریبی 1.1 کیلوباز بین تقاطع 2 اگزون وارد میشود. طی فرآیند پیرایش، گروه هیدروکسیل از نوکلئوتید گوانوزین در یک واکنش ترنس استریفیکیشن در جایگاه پیرایش '5 شرکت میکند. نیمه '5 اینترون برش میخورد و گروه هیدروکسیل آزاد شده انتهایی، در واکنش ترنس استریفیکیشن دوم در جایگاه پیرایش '3 شرکت میکند. در نتیجه این امر، ناحیه دخولی به همراه اگزونها حلقوی شده و اینترون '3 حذف میشود. b پیش بینی شکل تا خوردگی RNA از ساختار ثانویه RNA پیش ساز برای طراحی بازوی هومولوگ. رنگها احتمال جفت شدن بازها را نشان میدهند، رنگ قرمز احتمال بالاتر را نشان میدهد. بدون بازوهای همسانی، هیچ جفتشدگی بازی بین انتهای مولکول پیشساز پیش بینی نمیشود. c ژل آگارز که اثر بازوهای هومولوژیک را بر پیرایش نشان میدهد. همانطور که نشان داده شده است، RNA حلقوی گویا با وزن مولکولی بالاتری نسبت به RNA پیشساز حرکت می کند. (-): بدون هومولوژی. ضعیف: بازوهای هومولوگ ضعیف، 9 نوکلئوتید. قوی: بازو های هومولوگ قوی، 19 نوکلئوتید. d ژل آگارز تایید کننده حلقوی شدن ساختار. RNA :C پیشساز (با بازو های همسان) که در معرض شرایط حلقوی شدن قرار گرفته است. C+R: لاین C که در معرض هضم با RNase R قرار گرفته است. C+R+H: لاین C+R که در معرض هضم با RNase H هدایت شده با الیگونوکلئوتید قرار گرفته است.U: RNA پیشساز که در شرایط حلقوی شدن قرار نگرفته است. U+H: لاین U که با RNase H هدایت شده با الیگونوکلئوتید تیمار شده است. e خروجی توالی Sanger حاصل از RT-PCR نمونه گرفته شده از لاین C + R ران شده در شکل (d) در محل نقطه اتصال پیرایش (splice junction) به تصویر کشیده شده است.
شکل 2 - طراحی فاصلهگذار و پیرایش با استفاده از اینترون اتوکاتالیتیک آنابنا. a پیش بینی ساختار ثانویه RNA پیشساز و نحوه تا خوردگی آن در پی طراحی فاصلهگذار. ساختارهای ثانویه که به طور بالقوه در عملکرد ریبوزیم دخیل هستند توسط فلشهای سیاه مشخص شده اند. b ژل آگارز که اثر فاصلهگذارها را بر عملکرد پیرایش نشان میدهد. (-): بدون فاصلهگذار. D: فاصلهگذار مختل کننده. P1: فاصلهگذار سازگار 1. P2: فاصلهگذار سازگار2. c پیش بینی تاخوردگی ساختار ثانویه RNA پیشساز برای طراحی نواحی هومولوژی داخلی. عدم وجود هومولوژی قابل توجه داخلی (آنابنا 1.0) و ارائه هومولوژی داخلی (آنابنا 2.0) که با فلش های سیاه نشان داده شده است. حباب پیرایش به عنوان ناحیه ای بین بازوهای هومولوژی و مناطق هومولوژی داخلی که حاوی ریبوزیم پیرایشی است، نشان داده شده است. d ژل آگارز که اثر هومولوژی داخلی را روی پیرایش نشان میدهد. e ژل آگارز که واکنش پیرایش فاژ T4 بهینه شده را با واکنش پیرایشی آنابنا بهینه شده مقایسه میکند. نیمه اینترونهای آنابنا طول تقریباً برابر دارند و در مقایسه با نیمه اینترون های فاژ T4 علیرغم بازوهای هومولوژی قوی تر، احتمالاً بعد از پیرایش، کمتر کنار هم میمانند.
توالیهای فاصلهگذار[12] کارایی حلقوی سازی را بهبود میبخشند. به منظور بهبود بیشتر کارایی تولید circRNAهای حاصل از خودپیرایشی RNA پیشساز، عوامل دیگری را در نظر گرفتیم که ممکن است در حلقوی سازی موفقیت آمیز مؤثر باشند.
جایگاه پیرایش سرِ '3 PIE[13] مجاور IRES است و از آنجا که هر دو توالی دخولی ساختار بسیار سخت و با ثباتی دارند(انعطاف پذیری کمی دارند)، ما فرض کردیم که توالی درون IRES ممکن است، یا به صورت پروگرزیمالی درسرِ '3 و یا دیستالی در سرِ '5، در تاخوردگی مربوط به عمل پیرایش ریبوزیم، تداخل ایجاد کند. برای اینکه اجازه دهیم این ساختارها به طور مستقل تا بخورند، بین جایگاه پیرایش سر '3 PIE و IRES، که پیش بینی می کردیم در پیرایش تداخل ایجاد کند، یک سری فاصلهگذار طراحی کردیم (شکل 2a. ، داده های تکمیلی 1). " فاصلهگذارهای سازگار[14]" برای حفظ ساختارهای ثانویه موجود در توالیهای اینترون طراحی شده اند که ممکن است برای فعالیت ریبوزیم مهم باشند، در حالی که " فاصلهگذارهای مختل کننده[15]" برای ایجاد اختلال در توالی در هر دو نیمه اینترون، خصوصاً نیمه '5 طراحی شده اند. افزودن توالیهای فاصلهگذار سازگار طراحی شده باعث می شوند که کارایی پیرایش از 46 تا 87٪ (P1 و P2) افزایش یابد، در حالی که افزودن یک توالی فاصلهگذار مختل کننده فرآیند پیرایش را کاملا مختل میکند(شکل 2b.). این ساختار اصلاح شده، شامل بازوهای هومولوگ و فاصلهگذارهای با طراحی منطقی، توانست RNAیی را به طول 5 کیلوباز را حلقوی سازد (شکل اطلاعات تکمیلی 1.b).
اینترون کاتالیزوری آنابنا[16] انتخاب مناسبتری برای حلقوی سازی است. ما همچنین استفاده از جایگزینی گروه I اینترون کاتالیزوری مربوط به pre-tRNA Anabaena بررسی کردیم(20). در اینجا همان روش های بهینه سازی را که برای افزایش کارایی واکنش پیرایش اینترون فاژ T4 پس و پیش شده استفاده کردیم، به کار بردیم. جالب اینجاست که طی این بهینهسازیهای متوجه شدیم که تغییر اینترون کاتالیزوری T4 به اینترون کاتالیزوری آنابنا ممکن است منجر به ضعیف شدن یک کشش کوتاه بر هومولوژی درونی بین IRES و انتهای '3 ناحیه کدینگ، شود که این امر خود ممکن است به شکلگیری حباب پیرایش جدا شونده کمک کند(شکل 2c. ، شکل 3a.). تقویت هومولوژی داخلی نهایی، با استفاده از اینترون پس و پیش شده کاتالیزوری Anabaena، بازده اسپلایسینگ را از 84 به 95 درصد افزایش داد (شکل2.c ، d ، داده های تکمیلی 1). ما همچنین دریافتیم که استفاده از اینترون کاتالیزوری Anabaena منجر به کاهش 37٪ circRNA برش خورده در مقایسه با اینترون کاتالیزوری T4می شود (شکل 2.d ، e). با توجه به افزایش کارآیی پیرایش و بازده circRNA سالم، ثابت شد سیستم PIE آنابنا مهندسی شده نسبت به سیستم T4 PIE کارایی بهتری دارد(شکل 2e. ، شکل 2a. دادههای تکمیلی).
توالی های اتوکاتالیتیک با نواحی رمزگذار سازگار هستند. هومولوژی داخلی بین اگزون 2 و توالی کد کننده GLuc باعث شده سیستم PIE بهینه شده آنابنا با نواحی بینابینی غیر-GLuc مداخله کننده ناسازگار باشد. بر اساس درکمان از پارامترهایی که بر کارایی پیرایش اینترون های گروه 1 کاتالیتیک پس و پیش شده اثر میگذارند و به منظور سازگاری ساختار circRNA با حلقوی شدن کارآمد طیف وسیعی از توالی های RNA بینابینی طویل، دوباره یک جفت توالی فاصلهگذار جدید، طراحی کردیم. این توالیهای فاصلهگذار با سه اولویت مهندسی شدند: (1) با توالیهای پروگزیمال اینترون و IRES غیر هومولوگ بوده و فاقد ساختار سخت[17] باشند. (2) ساختار های ثانویه اینترون و IRES جدا باشند و بنابراین هر عنصر قادر به عملکرد و تاخوردگی مستقل از دیگری باشند و (3) به منظور پیشروی یک جایگاه برای تشکیل حباب پیرایش شامل توالیهای کناری اینترونی کاتالیتیک به وسیله مناطق دارای هومولوژی، دارای یک منطقه مکمل فاصلهگذار – فاصلهگذار باشند(شکل 3.a ، اطلاعات تکمیلی 1). ما همچنین بازوهای هومولوگ در انتهای '3 و '5 مولکول پیشساز RNA قرار دادیم. در ادامه بین این توالی ها، IRES یک ویروس EMCV، و همچنین نواحی رمزگذار 5 پروتئین مختلف شامل گائسیا لوسیفراز (GlLuc) (طول کل: 1289 نوکلئوتید)، فایرفلای لوسیفراز[18](2348نوکلئوتید)، eGFP (1451نوکلئوتید)، اریتروپویتین انسان (1313نوکلئوتید) و اندونوکلئاز Cas9 (4934نوکلئوتید) را درج کردیم. ما قادر به حلقوی کردن هر در هر پنج توالی RNA بودیم(شکل 3.b ، اطلاعات تکمیلی 1). راندمان حلقوی سازی با ساختار طراحی شده مرحله به مرحله ما (شکل 2e) مطلوب بود و دخول های مختلف بسیار تکرار پذیر بود، اما همچنان به اندازه قطعه دخولی وابسته بود، با RNA های طولانی حلقویسازی کندی رخ میدهد (شکل تکمیلی 3a.). علاوه بر این دریافتیم که circRNA های طویل در حضور یون های منیزیم بیشتر مستعد شکستگی و برش هستند، و در نتیجه انباشت circRNA شکسته در طی و پس از رونویسی آزمایشگاهی و هضم با RNase R رخ میدهد که این در نهایت باعث کاهش بازده کلی و خلوص نمونه تیمار شده Rnase R میشود (شکل 3.b ، c ، شکل تکمیلی 3a.). با این وجود RNase R قادر به هضم کامل اینترون های مقاوم آنابنا نیست(شکل 3b ، باندهای پایینی) و یا گاه حلقه های نادری که تقریباً 1.07٪ از واکنش های اسپلایسینگ را شامل میشوند دیده میشوند(شکل 3b ، باند های ضعیف).
circRNA اگزوژن به طور مؤثر ترجمه شده است. نشان داده شده است که circRNA درونزاد ممکن است مقادیر کمی از پروتئین را تولید کند(7). به عنوان ابزاری برای ارزیابی توانایی تولید پروتئین از circRNAهای مهندسی شده، محصولات پیرایشی هضم شده با RNase R هر ساختار را به سلولهای کلیوی جنینی انسان (HEK293) انتقال دادیم. انتقال circRNA گائسیا لوسیفراز (GLuc) یا فایرفلای لوسیفراز، منجر به تولید بالای پروتئین عملکردی شد که توسط لومینسانس اندازه گیری می شود (شکلهای 3. D، F). به همین ترتیب، توانستیم اریتروپوئیتین انسانی حاصل از انتقال circRNA اریتروپویتین را در محیط کشت سلولی تشخیص دهیم، و همچنین توانستیم فلوئورسانس eGFP حاصل از انتقال circRNA مربوط به eGFP را نیز مشاهده کنیم (شکل 3e ، g). کو-ترانسفکشن circRNA مربوط به Cas9با sgRNA هدایت شده بر ضد GFP به سلولهای HEK293 بیان کننده GFP، منجر به کاهش فلوئورسانس در 97٪ از سلولها در مقایسه با کنترلی که فقط sgRNA داشت، شد(شکل 3 h ، شکل تکمیلی 3 d , e). از آنجا که هضم با RNase R در واکنشهای اسپلایسینگ همواره کامل نیست و RNA پیشساز شامل IRES عملکری است، یک جهش حذف جایگاه پیرایش در ساختار GLuc را برای اندازه گیری سهم احتمالی ناخالصیها در بیان پروتئین ایجاد کردیم. هنگامی که مقادیر مساوی از واکنشهای پیرایش هضم شده به واسطه RNase-R ترانسفکت شدند، این جهش حذف جایگاه پیرایش یک سطح پروتئین به سختی قابل ردیابی رو تولید میکند(شکل تکمیلی 3.b ، c).
توالی IRES مربوط به CVB3 در ساختار circRNA عملکرد بهتری دارد. برای تثبیت circRNA اگزوژن به عنوان یک جایگزین قابل اعتماد برای فناوری mRNA خطی موجود، مطلوب است که بیان پروتئین به حداکثر برسد. ترجمه مستقل از Cap با واسطه IRES می تواند سطوح مختلفی از کارآیی را بسته به بافت سلولی نشان دهد و معمولاً وقتی که mRNA خطی دو-سیسترونی باشد، کمتر از ترجمه وابسته به Cap کارایی دارد(23). به طور مشابه، دم polyA باعث تقویت و بهبود بهره وری در شروع ترجمه در mRNA خطی از طریق پروتئین های اتصال پلی آدنیلات می شود(24, 25). با این حال کارایی توالی های مختلف IRES و دخول دم polyA در ساختار circRNA تا کنون بررسی نشده است. ما IRES مربوط به EMCV را با توالی UTR '5 چندین نسخه ویروسی، که به طور بالقوه یا قطعی، حاوی IRES های شناخته شده هستند، و همچنین چندین توالی IRES دیگر، جایگزین کردیم(داده های تکمیلی 1، شکل تکمیلی شکل 4a.)(26). بر این اساس دریافتیم که IRES مربوط به کوکساکی ویروس B3[19] (CVB3) 1.5 برابر کاراتر از IRES مربوط به EMCV متداول سازگار با سلولهای HEK293 است(شکل 4a). از آنجا که ساختارهای ثانویه، و به ویژه ناحیه کدینگ که مستقیماً در ادامه IRES است، نزدیک به IRES هستند(پروگزیمالند)، پتانسیل ایجاد اختلال در تاخوردگی و شروع ترجمه IRES را دارند. در ادامه همچنین توالیهای IRES ویروسی منتخبی را در ساختار فایر فلای لوسیفراز آزمایش کردیم. در حالی که همچنان CVB3 IRES از همه انواع دیگر IRES برتر بود، کارآیی چندین IRES دیگر، که مهمترین آنها IRES مربوط به پولیوویروس[20] است، به طرز چشمگیری تغییر یافت(شکل 4a.). پس از این آزمایش، بررسی کردیم که آیا اضافه کردن یک توالی polyA داخلی یا یک فاصلهگذار polyAC به عنوان کنترل به توالی IRES، که نشان داده بود توانایی بالاتر بردن تولید پروتئین را از سطح پیش زمینه از circRNA مهندسی شده دارد، میتواند بیان پروتئین را تغییر می دهد. ما دریافتیم که هر دو توالی، بیان را در تمام سازه ها بهبود بخشیده اند، احتمالاً این امر ناشی از جداسازی بیشتر با یک توالی غیر ساختاری، بین شروع توالی IRES و تقاطع جایگاه پیرایش اگزون-اگزون است، که پیش بینی میشود برای ایجاد یک ساختار پایدار کمک میکند(شکل 4b. ، شکل تکمیلی 4b.). این فاصله مازاد ممکن است ممانعت فضایی اتصال عامل شروع به ساختارهای IRES را کاهش دهد. در مورد EMCV و IRESهای پولیوویروس، توالیهای با فاصلهگذار پلی A بیان بیشتری نسبت به آنهایی داشتند که با فاصلهگذار پلی AC اصلاح شده بودند. این ممکن است نشان دهد که اجتماع پروتئین های متصل شونده پلی آدنیلات میتواند راندمان IRES را افزایش دهد. پس از انتخاب مؤثرترین ساختار polyA یا polyAC برای هر IRES ، ما اثر IRES را در انواع مختلف سلولها از جمله آدنوکارسینوم دهانه رحم انسانی[21] (HeLa) ، سرطان ریه انسان[22] (A549) و سلولهای بتای نامیرای پانکراسی موش[23] (Min6) بررسی کردیم. ما دریافتیم که اثر IRES بسته به نوع سلول متفاوت است، اما IRES مربوط به CVB3 در همه انواع تست شده بهتر بود(شکل 4.c ، d). حذف توالی های پروگزیمال یا دیستال نسبتاً کوتاه CVB3 IRES منجر به از دست رفتن چشمگیر بیان پروتئین می شود (شکل تکمیلی 4.c).
circRNA های حاصل از پیرایش میتوانند با HPLC تخلیص شوند. خلوص circRNA حاصله یکی از عوامل ضروری دیگر برای به حداکثر رساندن تولید پروتئین از circRNA و جلوگیری از پاسخ ایمنی سلولی ذاتی است. نشان داده شده است که حذف dsRNA توسط HPLC، فعال سازی و پاسخ سیستم ایمنی بدن را از بین می برد و ترجمه IVT mRNA (In Vitro-Transcribed) اصلاح شده توسط نوکلئوزید خطی را بهبود می بخشد(16).
شکل 3 - بررسی تاثیر حلقوی شدن و ترجمه برای یک طیف از circRNAهای کدکننده پروتئین تولید شده از RNA پیشساز مهندسی شده de novo.a طرح نشاندهنده طراحی عناصر مهندسی شده RNA پیشساز خودپیرایش. b ژل آگارز پیشسازهای RNA شامل IRES یک ویروس انسفالومیوکاردیت(EMCV)، و همچنین نواحی کدینگ 5 پروتئین مختلف شامل گائسیا لوسیفراز (GlLuc) (طول کل: 1289 نوکلئوتید)، فایرفلای لوسیفراز (2348نوکلئوتید)، eGFP (1451نوکلئوتید)، اریتروپویتین انسان (1313نوکلئوتید) و اندونوکلئاز Cas9 (4934نوکلئوتید) پس از حلقویسازی و حلقوی سازی مجدد درفقدان Rnase R (R−). circRNAها با تخریب RNAهای خطی به کمک تجزیه با RNase R (R+)، غنی میشوند. c بازده تقریبی circRNAها حاصل از تیمار 20 میکروگرم محصول پیرایش با RNase R ، که توسط اسپکتروفتومتری ارزیابی شده است (3 تکرار). d لومینسانس در سوپرناتانت سلولهایHEK293 24 ساعت پس از ترا آلائی با circRNA کدکننده برای GLuc (4 تکرار). e بیان اریتروپویتین انسانی در سوپرناتانت سلولهای HEK293 24 ساعت پس از ترا آلائی (تلقیح) با circRNA کدکننده hEpo که توسط ساندویچ (فاز جامد) ELISAارزیابی شده است(4 تکرار). f لومینسانس در لیز سلولهایHEK293 24 ساعت پس از ترانسفکشن(تلقیح) با CircRNA رمزگذار FLuc (4 تکرار). g فلورسانس GFP در سلولهای HEK293 24 ساعت پس از ترانسفکشن(تلقیح) با circRNA کدکننده EGFP (اسکیل بار: 400 میکرومتر). h آنالیز FACS(دسته بندی سلول های فعال فلوئورسنس) نشان دهنده کاهش GFP در سلول هایHEK293-EF1a-GFP 4 روز پس از ترا آلائی با sgGFP به تنهایی (circCas9−) و یا به همراه circRNA رمزگذار Cas9 (circCas9 +)، نشانگر ظاهر جمعیتی از سلولهای GFP منفی است. (تمام داده های ارائه شده به عنوان میانگین + SD ، * p <0.05 (آزمون t Welch))
شکل 4 - کارایی IRES در سلول ها و ساختارهای توالیهای مختلف. a لومینسنس در سوپرناتانت سلولهایHEK293 24 ساعت پس از ترا آلائی با circRNA حاوی پنلی از توالیهای ویروسی UTR IRES '5 در ساختار های GLuc (ستون سمت چپ، بنفش تیره با حاشیه سیاه) و FLuc (ستون سمت راست، بنفش روشن با حاشیه خاکستری). b لومینسنس در سوپرناتانت سلولهایHEK293 24 ساعت پس از ترا آلائی با circRNA حاوی یک توالی پلی A(30) یا یک توالی فاصلهگذار پلیAC(30) اضافه شده که IRES را از محل (تقاطع) پیرایش جدا (یا دور) میکند. (-): بدون فاصلهگذار. PAC: فاصلهگذار 30 نوکلئوتیدیشامل ادنوزینها و سیتوزینها. PA: فاصلهگذار 30 نوکلئوتیدی واجد آدنوزینها. c لومینسنس سوپرناتانت سلولهای HEK293 (ستون سمت چپ، بنفش تیره با حاشیه سیاه) و سلولهای HeLa (ستون سمت راست، بنفش روشن با حاشیه خاکستری) 24 ساعت پس از ترا آلائی با موثرترین IRES circRNAهایی که در (b) تعیین شده اند. d لومینسنس سوپرناتانت سلول های A549 (ستون سمت چپ، بنفش تیره با حاشیه سیاه) و سلول های Min6 (ستون راست، بنفش روشن با حاشیه خاکستری) 24 ساعت پس از ترا آلائی با موثرترین IRES circRNA هایی که در (b) تعیین شده اند (کلیه دادههای ارائه شده به عنوان میانگین + SD ، n = 4 ، * p <0.05 (آزمون t Welch)).
با این حال، هیچ روش دقیقی برای تخلیص circRNAها از محصولات جانبی IVT و واکنشهای حلقوی سازی که ممکن است شامل dsRNAها و تری فسفات-RNAهایی باشند (درگیرکنندۀ حسگرهای RNA و القای واکنش ایمنی سلولی)، گزارش نشده است(16). با این حال در حالی که اجتناب کامل از circRNA شکسته[24] به دلیل تجزیه خفیف در طی پردازش غیرقابل تحقق بود، توانستیم با استفاده از استخراج ژل برای مقادیر اندک و جداسازی بر حسب اندازه با HPLC برای مقادیر بیشتر محصولات پیرایش، به خلوص قابل ملاحظه ای (90٪ حلقوی، 10٪ شکسته) دست یابیم(شکل 5a .، b). در هر دو مورد، تخلیص را با استفاده از تیمار RNase R انجام دادیم تا بیشتر RNA بریده شده و شکسته را از بین ببریم. هنگامی که بیان پروتئین محصولات پیرایش هضم شده با RNase-R را که در آنها circRNA با استفاده از استخراج از ژل یا HPLC تخلیص شده مقایسه کردیم، فهمیدیم که تخلیص با استفاده از HPLC روشی بهتر نسبت به تخلیص با RNAse R به تنهایی است (شکل 5.b ، c).
شکل 5 - تخلیص circRNA حاصل از پیرایش با استفاده از HPLC. a کروماتوگرام HPLC از GLuc RNA خطی (بالا) و محصول پیرایش CVB3-GLuc-pAC (وسط). قطعات گردآوری شده ژل آگارز (پایین). b ژل آگارز CVB3-Gluc-pAC با روشهای مختلف تخلیص شد. C: واکنش پیرایش. +R: واکنش پیرایش تیمار شده با Rnase R. +G,R: محصول واکنش پیرایش از ژل استخراج شده و سپس با Rnase R تیمار شده. +H,R: محصول واکنش پیرایش با HPLC تخلیض شده و سپس با Rnase R تیمار شده. c لومینسانس در سوپرناتانت سلولهای HEK293 24 ساعت پس از ترا آلائی با محصولات پیرایش CVB3-GLuc-pAC تخلیص شده با روشهایی که در شکل b اشاره شده است(داده های ارائه شده به عنوان میانگین + SD ، n = 4 ، * p <0.05 (آزمون t Welch)).
تولید پروتئین circRNA با mRNA خطی قابل رقابت است. تا کنون مشخص نبوده که آیا کارایی ترجمه سلولی circRNA برونزاد با mRNA خطی متناظر آن قابل مقایسه است، و آیا تولید پروتئین circRNA تفاوتهایی در پایداری دارد یا خیر. با استفاده از circRNA مهندسی شده تخلیص شده با HPLC، ثبات و عملکرد circRNA کد کننده گائسیا لوسیفراز (CVB3-GLuc-pAC) با مقادیر یکسان از mRNA خطی GLuc که کلاهک 5' متیل گوانوزین و دم پلی A 3' اصلاح نشده دارد و همچنین مقادیر یکسان از mRNA خطی GLuc یک نوکلئوزید تجاری مدیفای شده (متعلق به کمپانی Trilink) (با نوکلئوزیدهای اصلاه شده سودو یوریدین و 5-متیل سیتوزین) مقایسه کردیم. تولید پروتئین که توسط لومینسانس 24 ساعت پس از تراآلائی مورد ارزیابی قرار گرفت نشان داد که circRNA معادل 811.2% پروتئین بیشتری نسبت به mRNA خطی اصلاح نشده در این زمان اولیه در سلولهای HEK293 تولید میکند (شکل 6a.). جالب توجه است، circRNA همچنین 54.5٪ پروتئین بیشتر از mRNA اصلاح شده تجاری تولید میکند. این نشان میدهد که اصلاحات نوکلئوزید برای تولید پروتئین قوی از circRNA ضروری نیست. نتایج مشابهی در سلولهای HeLa (شکل 6a.) و با استفاده از circRNA بهینه کد کننده برای پروتئین اریتروپویتین انسانی در مقایسه با mRNA خطی اصلاح شده با 5- متوکسی یوریدین به دست آمد (شکل تکمیلی 5.a ، b). داده های لومینسانس گرد آوری شده طی 6 روز نشان داد که تولید پروتئین از circRNA نسبت به mRNA خطی در سلولهای HEK293 بیشتر است، با circRNA نیمه عمر تولید پروتئین 80 ساعت است، در حالی که نیمه عمر تولید پروتئین از mRNA خطی اصلاح نشده و اصلاح شده حدود 43 تا 45 ساعت است(شکل 6b.). با توجه به افزایش بیان یا پایداری، circRNA همچنین پروتئین بسیار بیشتری از هر دوی mRNAهای خطی اصلاح نشده و اصلاح شده در طول عمر خود تولید میکند، در حالی که حتی در جایی که بیان اولیه ضعیف ترباشد (در اطلاعات تکمیلی) فنوتیپ پایدارتری را نشان میدهد (شکل 6c. ، شکل تکمیلی 6c.). در سلولهای HeLa ، circRNA نیمه عمر تولید پروتئین 116 ساعت را به نمایش گذاشت، در حالی که نیمه عمر تولید پروتئین از mRNA خطی اصلاح نشده و اصلاح شده به ترتیب تقریبا 44 و 49 ساعت بود(شکل 6d.).
شکل 6 - کارایی ترجمه از circRNA در مقایسه با mRNA خطی. a لومینسانس سوپرناتانت سلولهای HEK293 (چپ، خط بیرونی سیاه) و سلولهای HeLa (راست، خط بیرونی خاکستری) 24 ساعت پس از ترا آلائی با circRNA CVB3-GLuc pAC یا mRNA خطی ژن Gluc اصلاح شده یا اصلاح نشده (n = 4 HEK293, n = 3 HeLa). b لومینسانس سوپرناتانت سلولهای HEK293 از 24 ساعت پس از ترا آلائی با circRNA کدکننده CVB3-GLuc-pAC یا mRNA خطی ژن GLuc - اصلاح شده با متوکسی یوریدین یا اصلاح نشده که تا مدت 6 روز ادامه مییابد (4 تکرار). c لومینسانس تجمعی نسبی بیش از 6 روز توسط سلولهای HEK293 (چپ، خط بیرونی سیاه) و سلولهای HeLa (راست، خط بیرونی خاکستری) ترآلوده شده با circRNA کدکننده CVB3-GLuc-pAC یا mRNA خطی ژن GLuc اصلاح شده یا اصلاح نشده (n = 4 HEK293, n = 3 HeLa). d لومینسانس در سوپرناتانت سلولهای HeLa از 24 ساعت پس از انتقال با circRNA رمزگذار CVB3-GLuc-pAC یا mRNA خطی ژن GLuc - اصلاح شده که به مدت 6 روز ادامه می یابد (3 تکرار). (کلیه داده های ارائه شده به عنوان میانگین + SD ، * p <0.05 (آزمون t Welch))
در اینجا نیز افزایش قابل ملاحظه تولید پروتئین توسط circRNA در طول عمر آن، در مقایسه با هر دو mRNA های خطی اصلاح نشده و اصلاح شده دیده میشود(شکل 6c). ما این بیان افزایش یافته یا با ثبات را حتی در یک پیشساز circRNA کلاهک دار و پلی آدنیله شده، حاوی کلیه توالیهای جانبی نیز مشاهده نکردیم (شکل تکمیلی 6.a ، b).
بحث
دستیابی به تولید پروتئین پایدار از mRNA برونزاد یک هدف دیرینه در بیوتکنولوژی mRNA است. تلاش های قبلی برای افزایش پایداری mRNA پیشرفت های اندکی داشته است(10, 13-16). امکان سازگاری RNA حلقوی به منظور افزایش پایداری mRNA به علت کارایی پایین تولید circRNAها، دشواری تخلیص circRNAها و بیان ضعیف پروتئین توسط آنها تا کنون نادیده گرفته شده است. در واقع، این ها موانعی هستند که باید پیش از ارزیابی کامل ثبات تولید پروتئین از circRNA به طور کامل برطرف شوند. پیش از این، سیستم مبتنی بر اینترون کاتالیتیک گروه 1 پس و پیش شده برای حلقوی کردن طیف گسترده ای از توالی های RNA کوتاه در شرایط آزمایشگاهی استفاده شده است؛ گزارش شده است که کارآیی حلقوی سازی در RNA های بین 58 و 124 نوکلئوتید به 90٪ میرسد(20, 21). RNAهای طولانی تر (حداکثر تا 1.5 کیلوباز) به تازگی با استفاده از همین روش حلقوی شده اند، اما بازده circRNA های مربوط به این ساختار ها گزارش نشده است (27). سیستم مبتنی بر اینترون کاتالیتیک گروه 1 پس و پیش شده مهندسی شده که در اینجا شرح داده شده، اجازه میدهد توالی هایی به طول حتی تا 5 هزارباز حلقوی شوند، که بهطور قابل توجهی طویلتر از توالیهای قبلاً گزارش شده است. علاوه بر این، ما می توانستیم کارایی حلقوی سازی را، برای طیف وسیعی از نواحی رمزگذار دخولی با ترکیب توالی متنوع، تقریباً به 100٪ برسانیم. همچنین نشان دادیم که circRNA بهینه سازی شده، قادر به تولید مقادیر زیادی پروتئین است و همچنین میتواند با استفاده از HPLC به طور موثری تخلیص شود. سرانجام، نشان دادیم که circRNA می تواند مقادیر بیشتری از پروتئین را مدت زمان طولانیتر نسبت به RNAهای خطی (اصلاحنشده و اصلاحشده) مورد استفاده در این مطالعه، تولید کند. این شواهد نشان میدهد که circRNA دارای پتانسیل مناسبی برای جاگزینی mRNA در بیان پایدار پروتئین است. با این حال، باید کار بیشتری انجام شود تا به طور کامل پتانسیلهای استفاده از circRNA در کاربردهای درمانی و غیر درمانی از جمله بهینه سازی بیشتر ترجمه پروتئین از circRNA و یک مطالعه جامع در مورد کارآیی ترجمه و پایداری circRNA در سایر انواع و بافتهای سلولی بررسی شود. برش و شکست circRNA های طویل مشاهده شده طی فرآیند تولید circRNAها (شکل 2a. تکمیلی) که احتمالاً توسط اتوهیدرولیز به واسطه منیزیم(28)، انجام میشود، به طور قابل توجهی بازده پیرایش را کاهش میدهد و نقص دیگری است که نیاز به بهبود دارد. circRNA های طویلتر با توجه به اندازهشان فرصت بیشتری برای اتو هیدرولیز پیدا میکنند. این تخریب برای circRNA نسبت به RNA خطی مشهودتر است زیرا تنها یک برش در circRNA به صورت یک تک باند بر روی ژل آشکار می شود، در حالی که تک برش های RNA خطی به شکل اسمیر در طیف وسیعی از وزنهای مولکولی پخش میشود. این پدیده در شکل 3.b ، چاهک 7 (FLuc ، R-، و همچنین چندین چاهک دیگر) قابل مشاهده است. دو باند اصلی در این چاهک وجود دارد، باند بالایی نشان دهنده circRNA دست نخورده است در حالی که باند اصلی پایین نشان دهنده circRNA برش خورده است. هیچ اسمیری اطراف باند circRNA دست نخورده دیده نمیشود، در حالی که اسمیر در اطراف باند circRNA برش خورده قابل مشاهده است. باند circRNA برش خورده نشان دهنده برش های منفردی است که در موقعیتهای تصادفی در یک circRNA برش نخورده اتفاق می افتد، در حالی که اسمیری که از آن باند منشا مییابد، نشان دهنده برش های اضافی است که در موقعیتهای تصادفی در circRNA خطی شده رخ میدهد؛ بنابراین این برش باعث شکلگیری محصولات با وزن های مولکولی مختلف می شود. انتظار نداریم که برش circRNA، چالشهایی فراتر از چالش های حفظ پایداری RNA خطی در محلول و در طول پردازش، ایجاد کند.
اخیراً نشان داده شده است که تراآلائی سلولها با circRNA برون زاد منجر به فعال شدن محصولات ژن ضد ویروسی مانند OAS ، PKR و RIG-I میشود و احتمالاً RIG-I مؤلفه اصلی مسئول پاسخ سلول در برابر circRNA است(27). در ادامه ما مراتب آماده سازی circRNA خود را برای بررسی این که پاسخ سیتوکینی IFN-ɑ و IL-6 در سلولهای A549 نسبت به گروه کنترل ناترا آلوده مشاهده کردیم، اگرچه این پاسخ با پاسخ مربوط به mRNA های خطی اصلاح نشده قابل مقایسه بود (شکل تکمیلی شکل 7a). همچنین یک القاء 30 برابری از IFN-β1 و یک القاء 3 برابری از رونوشت های RIG-I پس از ترا آلائی سلولهای HeLa با circRNA، در مقایسه با ترا آلائی مُک[25] (شکل تکمیلی 7.b) انجام شد. مشاهده کردیم اثر القای 3 برابری mRNAی RIG-I به طور قابل توجهی کمتر از القا 500 برابری بود که توسط چن و همکاران در سلول های HeLa (27) گزارش شده است و برای سرکوب ترجمه پروتئین و پایداری بیان پروتئین از circRNA در این محتوای سلولی کافی نبود (شکل 6d.). تفاوتهای مشاهده شده در فعال سازی RIG-I را می توان به تفاوت در ساختار طراحی و روشهای تخلیص circRNA نسبت داد. برای سرکوب بیشتر یک پاسخ ایمنی در مقابل circRNA، روشهایی مانند اصلاح نوکلئوزید به طور بالقوه میتواند در طراحی circRNA گنجانیده شود(13, 16). همچنین تجزیه و تحلیل بیشتری برای بررسی ایمنی زایی circRNA اگزوژن در زمینه کارکردهای بالقوه، مورد نیاز است.
سرانجام، نشان دادیم که در شرایط آزمایشگاهی، circRNA با استفاده از یک واکنشگر ترا آلائی لیپیدی کاتیونی به خوبی سلولهای هدف منتقل می شود. با این حال، تحقیقات تکمیلی در مورد ابزار مناسب برای تحویل circRNA در شرایط in vitro و in vivo مورد نیاز است.
روشها
کلونیگ و جهش زایی. توالی رمزگذار پروتئین، گروه I اینترونهای خودپیرایشی و توالیهای IRES به روش شیمیایی سنتز شدند (Integrated DNA Technologies) و در یک حامل پلاسمیدی خطی شده با PCR که حاوی توالی پروموتری RNA T7 پلیمراز است توسط روش گیبسون اسمبلی و با استفاده از کیت اسمبلی NEBuilder HiFi DNA (متعلق به شرکتNew England Biolabs) کلون شدهاند. نواحی فاصلهگذار، بازوهای هومولوگ و سایر تغییرات جزئی با استفاده از کیت جهش زایی هدفمند Q5 (Biolabs New England) ایجاد شدند. پرایمرهای استفاده شده در فایل جداگانه ای ارائه شده اند.
طراحی circRNA و تخلیص آن. ساختار RNA با استفاده از RNAFold پیش بینی شد(18). mRNA خطی ژن Gluc اصلاح شده از Trilink Biotechnologies خریداری شد و شامل ناحیه کدینگ GLuc بهینه سازی شده، و یک منطقه اختصاصی مصنوعی 5' UnTranslated Region، و یک آلفا گلوبین 3′ untranslated region، یک کپ، یک دم پلی A 120 نوکلئوتیدی و جایگزینی کامل یوریدین و سیتوزین در کل mRNA با pseudouridine و 5 متیل سیتوزین است. mRNA ژن hEpo اصلاح شده نیز از بیوتکنولوژی Trilink تهیه شد و از نظر ساختاری با mRNA Trilink Gluc یکسان بود، به جز اینکه با 5-methoxyuridine اصلاح شده و منطقه رمزگذار برای اریتروپویتین انسانی اصلاح شد. RNA خطی اصلاح نشده شامل یک ناحیه رمزگذار GLuc یا hEpo بود اما مناطق خاص ترجمه نشدنی(UTR) را شامل نمیشد. پیش سازهای mRNA خطی اصلاح نشده یا circRNA با رونویسی در شرایط in vitro از یک الگوی DNA پلاسمیدی خطی با استفاده از یک کیت سنتز RNA با بازده بالا T7 (Biolabs New England) ساخته شدند. پس از رونویسی در شرایط in vitro ، واکنش دهندهها به مدت 20 دقیقه تحت تیمار DNase I (New England Biolabs) قرار گرفتند. پس از تیمار با DNase ، mRNA خطی اصلاح نشده با استفاده از کیت کیلن آپ رونویسیMEGAclear (Ambion) با ستون تخلیص شد. سپس RNA به مدت 5 دقیقه در دمای °C70 گرم شد و بلافاصله به مدت 3 دقیقه روی یخ قرار گرفت و پس از آن RNA با استفاده از mRNA cap-2′-O methyltransferase (NEB) و آنزیم کپینگ واکسینیا (NEB)، تحت دستورالعمل سازنده، کلاهک گذاری شد. با استفاده ازE. coli PolyA Polymerase (NEB) مطابق دستورالعمل سازنده، دمهای پلی آدنوزین به رونوشت خطی اضافه شدند و mRNA کاملاً پردازش شده با ستون تخلیص شد. برای circRNA، پس از تیمار باDNase ، GTP تا غلظت نهایی 2 میلی مولار اضافه شد و سپس واکنش دهندهها در 55 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه گرم شدند. سپس RNA به روش ستونی تخلیص شد. در بعضی موارد، RNA خالص شده به صورت مجدد تحت شرایط حلقوی شدن قرار گرفت: RNA به مدت 5 دقیقه تا °C70 گرم شد و سپس بلافاصله به مدت 3 دقیقه در یخ قرار گرفت و پس از آن GTP به غلظت نهایی 2 میلی مولار به همراه بافر شامل منیزیم (50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.5; New England Biolabs) اضافه شد. در مرحله بعد RNA به مدت 8 دقیقه تا °C55 گرم شد و سپس با ستون تخلیص شد. برای تغلیظ CircRNA ، 20 میکروگرم RNA در آب رقیق شد (86 میکرولیتر نهایی) و سپس در °C65 به مدت 3 دقیقه گرم شد و در نهایت و به مدت 3 دقیقه روی یخ سرد شد. 20واحد RNase Rو 10 میکرولیتر از بافر 10 × RNase R(Epicenter) اضافه شد، و واکنش در °C37 به مدت 15 دقیقه انکوبه شد. 10 واحد RNase R دیگر نیز در میانه واکنش اضافه شد. RNA هضم شده با RNase با ستون تخلیص جدا شد. RNA روی ژلهای آگارز 2٪ E-gel EX2 (Invitrogen) روی iBase E-gel (Invitrogen) با استفاده از برنامه E-gel EX 1-2% جدا و تفکیک شد. لدرssRNA (NEB) به عنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. ما با استفاده از دیگر سیستمهای ژل آگارز قادر به جداسازی مناسب circRNA نبودیم. باندها با استفاده از transillumination نور آبی مشاهده شدند و با استفاده از ImageJ کمّی شدند. تصاویر ژل آگارز پردازش نشده در شکل تکمیلی 8 موجود است. تصاویر ژل آگارز پردازش نشده از جمله لدر های مربوط به ژلهای شکل های 1 و 2، در شکل تکمیلی 9 موجود است. برای استخراج ژل، باند های مربوط به circRNA از ژل خارج شدند و سپس با استفاده از کیت استخراج RNA ژل Zymoclean (Zymogen) استخراج شدند. برای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، 30 میکروگرم RNA در 3 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه گرم شد و سپس به مدت 3 دقیقه روی یخ قرار گرفت. RNA از طریق ستون جداسازی بر اساس اندازه ×4.6 300mm میلی متر با اندازه ذرات 5 میکرومتر و اندازه منافذ 200 (Sepax Technologies ؛ تعداد قطعه: 215980P-4630) بر روی HPLC سری 1100 Agilent در بافر TE RNase-free (10 میلی متر تریس، 1 میلی متر EDTA ، pH: 6) با سرعت جریان 0.3 میلی لیتر در دقیقه ران شد. RNA با جذب اشعه ماوراء بنفش در 260 نانومتر نوری تشخیص داده شد، اما بدون این که تحت تابش اشعه ماوراء بنفش قرار گیرد، جمع آوری شد. قطعات RNA حاصله با آمونیوم استات 5 مولار رسوب داده شدند، مجدد در آب حل شدند و سپس در بعضی موارد با RNase R همان طور که در بالا توضیح داده شد تیمار شدند.
آنالیز برش با RNase H. واکنشهای پیرایشی circRNA با RNase R غنی میشوند و سپس با ستون، تخلیص میشوند و در °C65 به مدت 5 دقیقه با حضور یک پروب DNA (داده های تکمیلی 1) در مقدار اضافی پنج برابر مولار، گرم میشوند و سپس در دمای اتاق aneal خواهند شد. واکنش دهندهها با RNase H ( Biolabs) در بافر واکنش ارائه شده به مدت 15 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد تیمار می شوند. RNA پس از هضم از ستون شسته میشود.
رونویسی معکوس و سنتز cDNA. برای توالی یابی مجاورت محل پیرایش، circRNA حاصل از واکنشهای پیرایش با RNase R تغلیظ شده و سپس برای تخلیص با ستون در °C65 به مدت 5 دقیقه گرم شدند و به مدت 3 دقیقه روی یخ سرد شدند تا ساختار ثانویه استاندارد را ایجاد کنند. واکنش رونویسی معکوس با Superscript IV (Invitrogen) انجام شد، همان طور که توسط سازنده با استفاده از یک پرایمر اختصاصی برای یک ناحیه داخلی circRNA توصیه شده است. محصول PCR برای توالی یابی با استفاده از Q5 پلیمراز (New England Biolabs) و یک جفت پرایمر پوشاننده اسپلایس جانکشن سنتز شد.
کشت بافت و ترا آلائی. سلولهای HEK293 ، HEK293-GFP ، HeLa و A549 (ATCC) در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5٪ CO2 در محیط کشت اصلاح شده Eagle Dulbecco (گلوکز 4500 میلی گرم در لیتر) با 10٪ سرم جنین گاوی(hiFBS ، Gibco) غیرفعال شده با حرارت و پنی سیلین / استرپتومایسین کشت داده شدند. سلولهای HEK293 و HeLa برای مایکوپلاسما منفی آزمایش شدند. به محیط Min6 (هدیه ای از گوردون C. وایر، مرکز دیابت Josos) علاوه بر این با 5٪ hiFBS ، 20 میلی مول HEPES (گیبکو) و محلول بتا-مرکاپتواتانول 50 میکرومولار (BioRad) اضافه شد. سلولها هر 2-3 روز پاساژ داده شدند. برای کلیه مجموعههای دادههای circRNA ارائه شده در شکل 2 به جز Cas9 ، 40-100 ng از محصولات پیرایش تیمار شده RNase R یا circRNA های تخلیص شده با HPLC به صورت معکوس به 10،000 سلول HEK293 / 100 میکرولیتر در هر چاهک از یک پلیت 96 تایی با استفاده از لیپوفکتامین MessengerMax منتقل شدند. برای Cas9 ، 100 نانوگرم از sgRNA رونویسی شده در شرایط in vitro، به صورت معکوس به تنهایی، و همراه با 150 نانوگرم محصول پیرایش Cas9 تیمار شده با RNase با استفاده از MessengerMax به 50،000 سلول HEK293-GFP / 500uL در هر چاهک از یک پلیت 24 چاهکی منتقل شد. برای کلیه مجموعه داده های RNA ارائه شده در شکل 3، مقادیر مساوی از هر RNA (معادل 40 تا 80 نانوگرم بسته به طول RNA) به طور معکوس به 10،000 سلول HEK293 ، HeLa یا A549 / 100 UL در هر چاهک پلیت 96 چاهکی منتقل شدند. برای آزمایشاتی که بیان پروتئین در نقاط زمانی مختلف مورد بررسی قرار گرفت، محیط ها در زمان های مشخص به طور کامل حذف و جایگزین شدند. سلولهای Min6 در پلیتهای 96 چاهکه بین 60-80٪ ترانسفکت شدند. اندازه نمونه ها بر اساس آزمایشات پایلوت برای تعیین واریانس سنجش و به حداقل رساندن مصرف واکنش دهندهها به نحوی که بتواند تفاوت معنی دارو قابل تشخیصی ایجاد کند، انتخاب شدند.
آنالیز بیان پروتئین. برای سنجش لومینسانس، سلولها و محیطها 24 ساعت پس از ترا آلائی گردآوری شدند. برای تشخیص لومینسانس از لوسیفراز گائسیا، 10-20 میکرولیتر از محیط کشت بافت به یک پلیت صاف و سفید با دیوار صاف (کورنینگ) منتقل شد. 25 میکرولیتر از معرف BioLux Gaussia Luciferase (New England Biolabs) شامل تثبیت کننده به هر نمونه اضافه شد و میزان لومینسانس بر روی یک میکروپلیت ریدر 200Pro Infinite (Tecan) پس از 45 ثانیه اندازه گیری شد. برای تشخیص لومینسانس از Firefly لوسیفراز، 100 میکرولیتر از معرف Bruc-Glo Luciferase (Promega) به هر چاهک اضافه شد، و مخلوط به مدت 5 دقیقه انکوبه شد. 100 میکرولیتر از محیط کشت و مخلوط معرف لوسیفراز به یک صفحه صاف و کف دیواره سفید منتقل شده و همان طور که در بالا توضیح داده شد، لومینسانس اندازه گیری شد. فلوئورسانس GFP 24 ساعت پس از ترا آلائی شناسایی شد و تصاویر با استفاده از یک تصویرگر سلول EVOS FL (Invitrogen) گرفته شد. اریتروپویتین توسط ساندویچ فاز جامد ELISA (R&D Systems) اساساً مطابق دستورالعمل سازنده تشخیص داده شد به جز سوپرناتانت سلولی که 24 ساعت بعد از ترا آلائی استفاده شد و نمونه ها قبل از استفاده 1: 200 رقیق شدند. Interferon-ɑ و interleukin 6 با روش ایمونواَسی Fireplex (Abcam) تشخیص داده شدند.
فلوسایتومتری. خاموشی GFP با واسطه CRISPR-Cas9 با فلوسیتومتری جریان 96 ساعت پس از ترا آلائی تشخیص داده شد. سلولهای کنترل HEK293-GFP و HEK293 در محیط اصلاح شده Dulbecco (4500 mg / L گلوکز) با 10٪ سرم جنینی گاو و پنی سیلین / استرپتومایسین تریپسینه شدند و به حالت تعلیق درآمدند. سلولها سپس دو بار در بافر FACS (PBS ، 5% سرم جنینی گاو غیر فعال شده با گرما) شسته شدند و در بافر FACS حاوی Sytox Blue Dead Cell Stain (ترمو فیشر) طبق دستورالعمل های سازنده، یا بافر FACS به تنهایی برای GFP و کنترل های خالی دوباره تعلیق شدند. فلوئورسانس برای 10000 رویداد بر روی یک فلوسیتومتر جریان BD FACS Celesta (BD Biosciences) تشخیص داده شد. داده ها در Flowjo (Flowjo LLC) تجزیه و تحلیل شد.
رونویسی معکوس و qPCR. در مجموع 50،000 سلول HeLa با 200 نانوگرم از GLuc circRNA یا mRNA خطی اصلاح شده به طور معکوس تراآلوده شدند. سلولها شسته شدند و RNA پس از ترا آلائی با استفاده از کیت RNeasy Mini Plus (Qiagen) طبق دستورالعمل های سازنده، 24 ساعت بعد، برداشت و تخلیص شدند. سنتز cDNA رشته اول از RNA کل با کیت رونویسی معکوس cDNA با ظرفیت بالا با استفاده از هگزامرهای تصادفی انجام شد (ترمو فیشر علمی). پرایمرهای TaqMan اختصاصی ژن به عنوان Assay-on-Demand از (Thermo Fisher Scientific) ، GAPDH (Hs99999905_m1) ، DDX58 (Hs01061436_m1) ، IFN-β1 (Hs01077958_s1) خریداری شدند. واکنش qPCR با استفاده از ابزار LightCycler 480 Probe Master Mix (Roche) و ابزار LightCycler 480 (Roche) انجام شد. برای هر نمونه، واکنش real-time PCR به صورت دوتایی انجام شد و میانگین مقادیر چرخه آستانه(Ct) به دست آمده برای محاسبات بیشتر با استفاده از روش مقایسه Ct مورد استفاده قرار گرفت. سطح بیان ژن با سطح بیان ژن هاوس کیپینگ GAPDH نرمالایز شد.
محاسبات آماری. تجزیه و تحلیل آماری نتایج با استفاده از آزمون t زوج و بدون زوج Welch انجام شد، با فرض واریانس نابرابر. اختلاف معنی دار در نظر گرفته شد که P <0.05. برای کلیه مطالعات، داده های ارائه شده نماینده یک آزمایش مستقل است.
[1] Backsplicing
[2] Decapping Enzymes
[3] In Vitro Transcribed
[4] Permuted : پرمیوت در اینجا به جا به جا شدن جایگاه اینترون و اگزون اشاره دارد (مترجم).
[5] Permuted Intron-Exon
[6] Internal Ribosome Entry Site: جایگاه درونی ورود ریبوزوم
[7] EncephaloMyoCarditis Virus
[8] Gaussia luciferase
[9] Permuted group I catalytic Pntron
[10] Thymidylate Synthase
[11] homology arms
[12] spacer
[13] Permuted Pntron-Exon
[14] Permissive spacers
[15] disruptive spacer
[16] Anabaena: سیانوباکتر رشتهای
[17] unstructured
[18] Firefly luciferase
[19] CoxsackieVirus B3
[20] Poliovirus
[21] Human cervical adenocarcinoma
[22] human lung carcinoma
[23] immortalized mouse pancreatic beta cells
[24] nicked
[25] Mock transfection: عبارت است ترانسفکشن بدون دی ان ای به منظور بررسی اثر بالقوه ترنسفکشن(مترجم)