مهندسی دقیق ژنوم در گیاهان به منظور بهبود عملکرد

نوع مقاله : مقاله مروری

نویسندگان
رحیم غزی 1
لیلا نژادصادقی 2
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد رشته ژنتیک و به‌نژادی گیاهی،گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
2 استادیار، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
چکیده
نیاز به بهبود عملکرد گیاهان زراعی به کمک فناوری‌های نوین مولکولی، جهت افزایش تولید محصولات غذایی در سراسر دنیا امروز بیش از گذشته احساس می‌شود. پیشرفت‌های اخیر در زمینه ویرایش ژنوم به کمک فناوری کریسپر، دستورزی هدفمند با کارایی بالا را در اکثر گیاهان زراعی ممکن ساخته است، بنابراین این نوید را می‌دهد که بهبود عملکرد گیاهان به کمک این ابزار شتاب بیشتری پیدا کند. در این مقاله به پیشرفت‌های CRISPR/Cas، انواع و کاربردهای آن در ویرایش ژنوم گیاهان و دستورزی‌های حاصل به کمک این تکنیک، پرداخته شده است. ابزارهای پایه‌ای ویرایش که امکان جایگزینی هدفمند نوکلئوتیدها را فراهم ساخته و سیستم‌های انتقالی مختلف به ویژه روش‌های عاری از DNA ۱که ویرایش ژنومی را به اصلاح گیاهان زراعی مرتبط می‌سازد بطور برجسته‌تر بیان شده‌اند. بطور خلاصه کاربرد ویرایش ژنوم در بهبود صفات، توسعه تنظیم دقیق بیان ژن، استراتژی‌های اصلاحی برای مقاومت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی و همچنین استفاده از کتابخانه‌های موتانتی با توان عملیاتی بالا از جمله مواردی است که در این مقاله به بحث و بررسی گذاشته شده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

اصلاح دقیق و هدفمند گیاهان به کمک فناوری CRISPR/Cas

رحیم غزی و لیلا نژادصادقی*

ایران، اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده کشاورزی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

تاریخ دریافت: 11/03/1401                 تاریخ پذیرش: 09/02/1402

چکیده

نیاز به بهبود عملکرد گیاهان زراعی به کمک فناوری­های نوین به­نژادی، جهت افزایش تولید محصولات غذایی در سراسر دنیا امروز بیش از گذشته احساس می­شود. پیشرفت­های اخیر در زمینه ویرایش ژنوم به کمک فناوری کریسپر، دستورزی هدفمند با کارایی بالا را در اکثر گیاهان زراعی ممکن ساخته است، بنابراین این نوید را می­دهد که بهبود گیاهان به کمک این ابزار شتاب بیشتری پیدا کند. در این مقاله به پیشرفت­های CRISPR/Cas9، انواع و کاربردهای آن در ویرایش ژنوم گیاهان و دستورزی­های حاصل به کمک این تکنیک، پرداخته شده است. ابزارهای پایه­ای ویرایش که امکان جایگزینی هدفمند نوکلئوتیدها را فراهم ساخته و سیستم­های انتقالی مختلف به ویژه روش­های عاری از DNA  که ویرایش ژنومی را به اصلاح گیاهان زراعی مرتبط می­سازد بطور برجسته­تر بیان شده­اند. بطور خلاصه کاربرد ویرایش ژنوم در بهبود صفات، توسعه تنظیم دقیق بیان ژن، استراتژی­های اصلاحی برای مقاومت به تنش­های زیستی و غیرزیستی از جمله مواردی است که در این مقاله به بحث و بررسی گذاشته شده است.

کلیدواژگان: اصلاح دقیق گیاهان، ویرایش ژنوم، کریسپر، هدف­گیری ژنی

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: L.nejadsadeghi@scu.ac.ir

مقدمه

 

در حال حاضر یکی از چالش­های پیش روی بشر، تامین امنیت غذای جمعیت در حال رشد دنیا است. پیش­بینی می­شود جمعیت کره زمین تا سال ۲۰۵۰ به ۱۰ میلیارد نفر برسد و برای تامین غذای این جمعیت لازم است تولیدات کشاورزی ۶۰ تا ۱۰۰ درصد میزان کنونی افزایش یابد (8). به منظور تغذیه جمعیت در حال رشد و در مواجه با معضلاتی مانند تغییرات اقلیمی، کاهش اراضی قابل کشت و محدود شدن منابع آبی در دسترس، نیاز فوری به فناوری­هایی در زمینه به­نژادی گیاهان زراعی که بتوانند تولیدات کشاورزی را ارتقا داده و کشاورزی پایدار را توسعه دهند، شدیداً احساس می­شود. اصلاح به کمک تلاقی، موتاسیون و انتقال ژن در حال حاضر مهمترین روش­های بهبود عملکرد گیاهان زراعی در کشاورزی مدرن هستند. سالیان درازی طول می­کشد تا به کمک تلاقی، آلل­های مطلوب معرفی گردد و تنوع لازم از طریق نوترکیبی ژنتیکی افزایش یابد. به دلیل هزاران سال تکامل مستقیم بواسطه انتخاب طبیعی، بخش­های بزرگی از ژنوم گیاهان زراعی مهم تثبیت شده و تنوع ژنتیکی شدیداً کاهش یافته است، در نتیجه پتانسیل بهبود بسیاری از صفات محدود شده است. اصلاح به کمک جهش تنوع ژنتیکی را از طریق معرفی جهش­های تصادفی با استفاده از مواد جهش­زای شیمیایی و یا فیزیکی توسعه داده است (30). با این حال این روش­ها نیز به دلیل ماهیت تصادفی بودن و تولید تعداد زیادی موتانت که می­بایست غربالگری شوند، چالش برانگیز هستند.

این قبیل برنامه­های اصلاحی وقت­گیر، پر هزینه و غیر هدفمند نمی­توانند همگام با تقاضای روزافزون برای محصولات زراعی گام بردارند، با وجودی که رویکردهای نوین به­نژادی مانند انتخاب به کمک نشانگرها کارایی این روش­ها را تا حدودی افزایش داده است (34). از زمان اولین آزمایش مبتنی بر هدف­گیری ژنی[1] در گیاه توتون در سال ۱۹۸۸ تا کشف این پدیده در سال ۱۹۹۳ که برش DNA  دو رشته­ای باعث افزایش کارایی هدف­گیری ژنی می­گردد، دانشمندان به دنبال یافتن ابزاری برای ویرایش هدفمند ژنوم در گیاهان بودند. در سال ۲۰۰۵ نوکلئازهای انگشت روی (ZFNs) در گیاه توتون سازگار و در بهبود صفات چندین گیاه دیگر نیز بکار گرفته شدند (45). در سال ۲۰۱۰ نوکلئازهای تاثیرگذار شبه فعال کننده رونویسی (TALENs) به جعبه ابزار ویرایش ژنوم در گیاهان افزوده شد (6). با وجودی که کاربرد این دو پلتفورم منجر به پیشرفت­های مهمی گردید، هر یک از این دو محدودیت­های خاص خود را داشت و استفاده از آنها در گیاهان، خارج از یک رویه معمول و روتین بود. اخیراً نیز فناوری ویرایش ژنوم به کمک سیستم CRISPR/Cas به یک فناوری شناخته شده در بسیاری از آزمایشگاه­های بیولوژیکی تبدیل شده است و پیش­بینی می­شود این ابزار در زمینه کشاورزی انقلاب سبز دوم را به کمک گشایش فصل جدیدی در اصلاح دقیق و هدفمند گیاهان رقم بزند. بعنوان یکی از بهترین و جدیدترین روش­های اصلاح گیاهان، CRISPR/Cas می­تواند مسیرهای جایگزین جدیدی برای اجتناب از روش­های مستقیم تولید موجودات تراریخته یا GMO فراهم نماید.

سیستم­های CRISPR/Cas

سیستم CRISPR/Cas با ترکیبی از آرایه­های تکراری فاصله­دار CRISPR و پروتئین Cas، یک سیستم ایمنی تطبیقی به واسطه RNA است که در باکتری­ها و آرکی­ها سیستم دفاعی علیه فاژها و دیگر عناصر ژنتیکی مهاجم را از طریق برش اسیدهای نوکلئیک ژنوم مهاجم فراهم ساخته است. بر اساس ویژگی خاص ژن­های پروتئین Cas و طبیعت مجموعه مداخله­گر، سیستم CRISPR/Cas به دو دسته تقسیم می­گردد و برحسب اثر پروتئین­های Cas آنها، در پنج گروه دسته بندی شده است: نوع I، II، III، V و VI. در نوع I مکانیسم CRISPR/Cas9 بصورت یک مجموعه آبشار تصور می­شود که شامل تعدادی از پروتئین­های Cas می­باشد که DNA  خارجی را توسط crRNA بعنوان یک ریبونوکلئوپرونئین برش می­دهند. در سیستم نوع III، کمپلکس Cmr که به crRNA متصل می­گردد، کار هضم DNA  خارجی را انجام می­دهد. کمپلکس پروتئینی نوع I و III بعنوان برش دهنده DNA  یا RNA خارجی عمل می­کنند در حالی که، Cas9 در سیستم نوع II، Cpf در نوع V و Cas13 در نوع VI بعنوان یک بخش واحد از پروتئین هضم کننده نوکلئوتیدی با crRNA همکاری می­نمایند و این در حالی است که Cas13 در سیستم نوع VI می­تواند بعنوان برش دهنده DNA  خارجی وارد عمل شود (25). هردو سیستم Cas9 و Cpf1 بعنوان ابزارهای قدرتمند بطور گسترده­ای در ویرایش ژنوم تعداد زیادی از گونه­ها بکار گرفته شده­اند.

یک ویژگی مهم و کلیدی در مورد سیستم CRISPR/Cas9 اطمینان از برش DNA  در هر دو رشته و در محل مورد نظر است که می­تواند برای معرفی یکی از روش­های متنوع دستکاری ژنوم به کمک یکی از دو مسیر ترمیم DNA  یعنی اتصال انتهایی غیرهمسان (NHEJ) (Non-homologous end joining) و ترمیم معطوف به همسانی (HDR) (homology-directed repair) استفاده گردد (شکل ۱- ب).

ویرایش ژنوم به کمک اتصال انتهایی غیرهمسان

مسیر ترمیمی NHEJ در اکثر مراحل چرخه سلولی ترجیح داده شده و نیاز به یک الگوی همولوگ جهت ترمیم ندارد. به همین دلیل به یک روش پرکاربرد و محبوب برای ایجاد اختلال در عملکرد ژن بواسطه ایجاد حذف یا اضافه در یک نقطه معینی از توالی هدف تبدیل شده است (شکل ۱- ب). NHEJ می­تواند در درج توالی DNA خارجی به روش مستقل از همسان­سازی بکار رود و در نتیجه یک روش کارآمد برای انباشت ژنی به منظور بهبود عملکرد گیاهان زراعی بکار گرفته شود.

یک مزیت بزرگ CRISPR نسبت به نوکلئازهای TALEN و ZFN این است که در این سیستم می­توان با استفاده از چند sgRNA و بیان یک پروتئین Cas9 یا Cpf1 چندین نقطه مورد نظر در ژنوم را بطور همزمان هدف قرار داد. ویرایش چندگانه می­تواند در مهندسی ژنوم کاربردهای پیچیده­ای از قبیل خاموشی چندژنی، حذف یا جابجایی کروموزومی و knock-in ژنی داشته باشد (32). تاکنون چندین روش برای دستیابی به بیان چندگانه gRNA از یک کاست در گیاهان استفاده شده است. یکی از بهترین روش­ها استفاده از یک پیش­بر (پروموتر) جهت دستیابی به بیان یکنواخت هر gRNA است به گونه­ای که این سیستم را در یک ناقل[2] کوچک جاسازی نماید تا حداکثر کارایی ویرایش حاصل گردد. این امر به کمک یک ساختار ژنی پلی­سیسترونی حاصل شده که در آن gRNA با استفاده از جایگاه­های ریبوزومی، جایگاه­های شناساگر Csy4 یا توالی­های RNA ناقل (47) پراکنده شده است، به نحوی که این ساختار در سلول­های گیاهی جهت رهاسازی gRNA بالغ و به منظور ویرایش ژنوم، فرآوری شده است. علاوه بر توانایی Cpf1 در فرآوری crRNA خودی، این پروتئین توانسته است روشی با کارایی بسیار موثر در ویرایش چندگانه ژنوم در گیاهان را فراهم سازد (40). از آنجا به کمک این مطالعات امکان تغییر همزمان چندین صفت فراهم گشته، کریسپر یک روش بسیار کارآمد در اصلاح صفات به شکل هرمی است.

 

 

 

شکل ۱-  سیستم­های کریسپر برای ویرایش ژنوم و دیگر مقاصد دستورزی. الف) دو سیستم کریسپر برای مهندسی ژنوم گیاهان: Cas9 و Cpf1. ب) ویرایش ژنوم به کمک کریسپر بسته به مسیر ترمیمی DBS می­تواند نتایج متفاوتی داشته باشد: I، II و III می­توانند نتیجه غالبیت مسیر ترمیمی NHEJ باشند در حالی که IV و V می­توانند در نتیجه فعالیت مسیر HDR که مبتنی بر استفاده از DNA  الگو است ناشی شوند. ج) بررسی اجمالی کاربردهای دستکاری ژنوم مبتنی بر همجوشی dCas9: پروتئین dCas9 در ترکیب با دیگر پروتئین­ها از جمله فعال کننده­ها یا سرکوب کننده­های رونویسی، عوامل دخیل در تغییرات اِپی­ژنتیک و پروتئین­های فلورسنت می­تواند در تنظیم بیان ژن، ویرایش اِپی­ژنوم و برچسب­گذاری ژنومی کاربرد داشته باشد. د) Cas13 می­تواند RNA را هدف قرار دهد و dCas13b می­تواند در ترکیب با ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) در ویرایش RNA بکار گرفته شود.

 

ویرایش

دقیق ژنوم به کمک مسیر ترمیمی مستقیم همسان

با وجودی که NHEJ بسیار کارآمد بوده و در مطالعات گسترده­ای که به منظور غیرفعال نمودن ژن­ها طراحی شد و عملکرد آن بخوبی شناخته شده است، اما فاقد دقت لازم برای مهندسی ژنوم­های پیچیده­تر می­باشد. از ویرایش ژنوم بواسطه HDR می­توان برای ایجاد جهش­های نقطه­ای دقیق جهت درج یا جایگزینی توالی­های مورد نظر در DNA هدف بهره برد (شکل ۱- ب). HDR در فاز S و G2 چرخه سلولی القا می­گردد. ترمیم DBS نیازمند یک الگوی همسان با محل برش است. الگوی ترمیم می­تواند کروماتید خواهری یا یک الگوی خارجی مانند یک DNA  بیرونی یا دی.ان.اِ تک رشته­ای حاوی توالی مورد نظر باشد که بتواند در جایگاه هدف گنجانده شود (32) (شکل ۱- ب). اصلاح دقیق ژنوم به کمک HDR در بسیاری از موجودات بطور گسترده به خدمت گرفته شده است. با این حال ارائه این سیستم بعنوان یک ابزار در هدف قرار دادن ژن­ها در گیاهان هنوز چالش برانگیز بوده و این به دلیل کارایی پائین HDR و محدودیت­های موجود در مسیر تحویل الگوی اهدایی به سلول­های گیاهی است. برای غلبه بر این محدودیت­ها تاکنون چندین رویکرد به منظور افزایش کارایی هدف­گیری ژن­ها بواسطه روش HDR در گیاهان ابداع شده است. استفاده از انتخاب مثبت منفی منجر به هدف­گیری موفق ژن­ها در برنج به روش Cas9 شده است (23).

دستورزی­های

فراتر از برش دورشته­ به کمک CRISPR/Cas9

کریسپر محدود به ایجاد برش­های دو رشته­ای نیست، dCas9 می­تواند بستر منحصر بفردی برای جذب پروتئین­ها به منظور تنظیم توالی ژنی خاص، ویرایش اِپی­ژنوم و تصویربرداری ژنومی فراهم سازد. دمین­های سرکوب کننده رونویسی و همچنین فعال کننده­های رونویسی همجوش با dCas9 می­توانند در تنظیم ژنی بکار روند (شکل ۱- ج). تنظیم هدفمند بیان ژن، دیدگاه­های جالبی را در مورد ژنوم گیاهان ارائه نموده است. لودر و همکاران (۲۰۱۵) اخیراً فعال­سازی و سرکوب همزمان چندین ژن را در گیاهان ارزیابی نموده­اند. یک سیستم سرکوبگر مصنوعی (pCo-dCas9-3X-SRDX) طراحی و در مورد ژنCLEAVAGE STIMULATING FACTOR64 و ژن­های غیر کدکننده مانند mi159A و mi159B ارزیابی شد (20). علاوه بر این، dCas9 متصل به چندین TALENs (یک dCas9-TV قدرتمند) فعالیت رونویسی قدرتمندی را به ژن­های هدف منفرد یا چندگانه نسبت به زمانی که dCas9-VP64 بطور معمول در سلول­های گیاهی و حیوانی استفاده شود، القا می­کند (17). dCas9 فاکتورهای دخیل در تغییرات اِپی­ژنتیک از قبیل هیستون دِمتیلاز LSD1، هیستون اَستیل ترانسفراز P300 و ده تا یازده پروتئین انتقالی را جهت تنظیم تغییرات اِپی­ژنتیک روی DNA یا هیستون­های هدف به خدمت می­گیرد (شکل ۱- ج). این امر می­تواند وضعیت تنظیم کروماتینی را تغییر دهد، در نتیجه  بیان ژن، تمایز سلولی و دیگر فرایندهای بیولوژیکی را نیز می­تواند تحت تاثیر قرار دهد (16).

 

ویرایش بازها در گیاهان

فراتر از ویرایش ژنوم بواسطه DSB، سیستم ویرایش بازی می­تواند تغیرات نوکلئوتیدی ویژه را که نه به HDR و نه DNA  اهدایی وابسته باشد القا نماید بطوری که در شکل­گیری DSBs مشارکتی نداشته اما در عین حال می­تواند کارایی بالا، سادگی و استراتژی جهانی را برای مهندسی جایگزینی نوکلئوتید در جایگاه­های هدف فراهم آورد.

سیستم ویرایش بازی سیتوزین (CBE)، که حاوی سیتیدین دِآمیناز متصل به nCas9 (D10A) و مهار کننده یوراسیل گلیکولاز می­باشد، سیتوزین هدف را در DNA  به یوراسیل تبدیل می­کند. در ابتدا سیتئین دِآمیناز سیتوزین موجود در DNA  را به یوراسیل تبدیل می­کند و در ادامه یوراسیل طی فرآیند همانندسازی DNA، با تیمین جایگزین می­گردد. طی این فرآیند، مهار کننده یوراسیل گلیکولاز متصل شده و سبب مهار یوراسیل DNA  گلی­کوزیلاز می­گردد، این مهار برش یوریدین، فعالیت ترمیمی مسیر برش بازی را تضمین و کارایی ویرایش بازی را بالا می­برد. سیستم کارآمد ویرایش بازی۳ (BE3) که شامل اتصال سیستئین دِآمیناز APOBEC1 موش می­باشد، بطور گسترده­ در ویرایش ژن گونه­های مختلف گیاهی و جانوری بکار گرفته شده است. اصلاحاتی که بر روی BE3 به منظور توسعه PAM صورت گرفته سبب افزایش کارایی و درجه اختصاصی این سیستم شده است (13). بطور مشابه، سه اورتولوگ سیستئین دِآمیناز یعنی PmCDA1 بدست آمده از مارماهی نوع انسانی AID و APOBEC3A (42) با Cas9 ترکیب شده و جایگزینی C با T با کارایی بالایی حاصل شده است.

روش­های انتقال سازه­های CRISPR/Cas به ژنوم گیاهان

همان گونه که در بالا اشاره شده سیستم CRISPR/Cas9 یک فناوری ساده بوده که به کمک مجموعه Cas9/sgRNA وارد عمل می­شود. برای مثال در ویرایش ژنوم حیوانات تنها به تزریق تخمک­های دارای پروتئین نوترکیب واجد Cas9 با یک سیگنال مستقر در هسته و سنتز مصنوعی sgRNA نیاز است (48). با این وجود ریزتزریقی برخلاف حیوانات در گیاهان با چالش­هایی روبرو است و به سادگی قابل استفاده نیست. به منظور معرفی سیستم CRISPR/Cas9 به سلول­های گیاهی روش­هایی مانند استفاده از اگروباکتریوم، انتقال مبتنی بر PEG و استفاده از تفنگ ژنی بکار گرفته شده است که هریک از این تکنیک­ها محاسن و معایبی دارد. اگروباکتریوم می­تواند  T-DNA را به گستره وسیعی از گیاهان از بریوفیت­ها گرفته تا گونه­های درختی انتقال دهد (جدول ۱).

 

 

جدول ۱- مقایسه روش­های انتقال سازه­های کریسپر به ژنوم گیاهان

روش

مزایا

معایب

اگروباکتریوم

- قابلیت استفاده در طیف وسیعی از گونه­های گیاهی

-  بیان پایدار

1) نیاز به بهینه­سازی برای هر گونه گیاهی

2) مسائل قانونی

PEG

توانایی انتقال پروتئین، RNPs و پلاسمید

1)چالش­های تکنیکی در یازیابی گیاهان

تفنگ ژنی

عدم محدودیت در نوع گونه گیاهی

1) تشخیص دشوار سلول­های تراریختی

2) درج تصادفی ژن

 

 

T-DNA درج شده به کمک اگروباکتریوم می­تواند بیان پایدار Cas9 و sgRNA جهت ویرایش ژنومی با کارایی بالا در گیاهان را تضمین نماید. با این حال ممکن است حتی در بین گونه­های مختلف یک گیاه زراعی کارایی انتقال کاملاً متفاوت باشد (33). از اینرو احتمالاً ضروری است برای گونه­های مختلف پروتوکل­های اختصاصی و کارآمد تدوین گردد. روش PEG که مبتنی بر استفاده از پروتوپلاست می­باشد این مزیت را دارد که ترکیبات متنوعی مانند RNPها انتقال یابند. کمپلکس Cas9/sgRNA به کمک این روش می­تواند به پروتوپلاست گیاه کاهو انتقال داده شده و ویرایش ژنومی عاری از DNA  را رقم بزند (44). از آنجا که بازیابی برخی از گیاهان از کشت پروتوپلاستی مشکل است، گستره گیاهانی که به کمک این روش قابل دستکاری هستند بسیار محدود است. تکنیک تفنگ ژنی به واسطه عدم محدودیت در انتقال مولکول­ها به گونه­های مختلف گیاهی، کاربرد وسیعی در انتقال ژن به گیاهان دارد. ویرایش ژنوم در گیاهانی مانند جو، ذرت، سویا و گندم به کمک این روش صورت گرفته است (18). از معایب این روش عدم تولید سلول­های تراریخته کافی می باشد که کار انتخاب سلول­های تراریخت شده واقعی را مشکل می­سازد. همچنین زمانی که ناقل­های پلاسمیدی به کمک این روش به سلول­های گیاهی انتقال داده می­شوند، این خطر وجود دارد که بخش­هایی از DNA خارجی وارد ژنوم گیاه گردد. با این حال، برای ویرایش ژنوم گیان لازم است یکی از این روش­ها انتخاب و جهت افزایش کارایی انتقال بهینه سازی گردد.

کاربردهای CRISPR/Cas در اصلاح دقیق گیاهان

بهبود صفات گیاهان زراعی از طریق ناک­­اوت[3] ژنی

از بین بردن یا محدود کردن صفات منفی یکی از استراتژی­های امیدوار کننده در اصلاح گیاهان است. از این رو ناک­اوت ژن­هایی که حامل صفات نامطلوب هستند، ساده­ترین و رایج­ترین کاربرد تکنیک CRISPR/Cas است (شکل ۲- الف). صفاتی که تا این تاریخ به کمک CRISPR/Cas9 ارتقاء یافته­اند شامل: عملکرد، کیفیت و افزایش مقاومت به تنش­های زیستی و غیرزیستی است. تکنیک­های اصلاح گیاهان هیبرید و بسیاری از جنبه­های مهم تولید گیاهان زراعی نیز به کمک این روش بهبود قابل توجهی حاصل نمودند.

افزایش عملکرد

نیاز به تامین امنیت غذایی، افزایش عملکرد را به اولین هدف ویرایش ژنی برای بهبود گیاهان زراعی تبدیل نموده است. عملکرد صفت پیچیده­ای بوده و تحت کنترل عوامل زیادی است. حذف تنظیم کننده­های منفی شناخته شده موثر بر شاخص­های تعیین کننده عملکرد مانند: تعداد دانه (OsGn1a)، اندازه دانه (OsGS3)، وزن دانه ( TaGW2, OsGW5, OsGLW2یا TaGASR)، اندازه سنبله و تعداد پنجه (OsAAP3) که سبب ایجاد فنوتیپ مورد انتظار در گیاه بدون ایجاد اختلال در عملکرد این ژنها گردد، این باور را بوجود آورده است که CRISPR/Cas9 ابزاری بسیار مفید و قدرتمند برای بهبود این گونه صفات است (5). حذف همزمان سه ژن مربوط به وزن دانه (GW2, GW5 و TGW6) در گیاه برنج منجر به هرمی شدن صفات گشته، که این امر سبب افزایش موثری در وزن دانه­ها شده است (47).

 

 

 

شکل ۲-  نمای کلی از کاربردهای CRISPR/Cas9 در اصلاح گیاهان: بهبود گیاهان زراعی به کمک این تکنیک روی عملکرد، کیفیت و افزایش مقاومت به تنش­های زیستی و غبرزیستی تمرکز نموده است. (الف) ایجاد جهش بکمک CRISPR/cas می­تواند محو، حذف­ژنی و یا ناکوت چندگانه ژن را تامین نماید. (ب) جایگذاری یا جایگزینی ژنی به واسطه ترمیم مستقیم همسان و یا ترمیم انتهایی غیرهمسان می­تواند منجر به تجمع ژنی برای ویژگی­های چندگانه، اصلاح ژنی جهت افزایش کارکرد و جایگذاری یا جایگزینی ژن به منظور تولیـد صفات جـدید در به­نژادی کاربرد داشته باشد. (ج) کاربرد ویرایش ژنی به منظور بهبود صفات گیاهان زراعی مانند: جایگزینی دقیق اسیدهای آمینه، اختلال ژنی از طریق جایگذاری کدون ختم، تنظیم ژنی و پایش کل ژنوم. (د) تنظیم ژنی مبتنی بر کریسپرکس از طریق ویرایش جایگاه­های تنظیم ژن در نواحی غیرترجمه شونده، پیش بر و بهبود دهنده­ها (enhancer). (ه)  استراتژی­های اصلاحی بر علیه ویروس­ها به کمک کریسپرکس: در این شیوه سیستم کریسپری واجد sgRNA که DNA  یا RNA ویروس را هدف قرار می­دهد در ژنوم گیاهی درج شده و سبب القا مقاومت نسبت به ویروس­های مهاجم می­گردد. (و) سیستم پایش گسترده ژنوم مبتنی بر کریسپرکس که ابزاری ارزشمند در ژنومیکس کارکردی و بهبود ژنتیکی است.

 

با این حال به دلیل پیچیدگی صفات کمی و کنترل آنها توسط مکان­های ژنی متعدد، خاموش کردن عوامل منفرد ممکن است برای افزایش عملکرد در شرایط مزرعه­ای کافی نباشد. ژو و همکاران (۲۰16) اخیراً روشی برای شناسایی گسترده ژن­های کنترل کننده صفات پیچیده مانند عملکرد به کمک ترکیبی از روش آنالیز شجره­ای، ویرایش ژنی، توالی­یابی کل ژنوم و فناوری CRISPR/Cas9 توسعه دادند (51).

بهبود کیفیت

صفات کیفی بسته به نیازهای ویژه اصلاحی و ذائقه مصرف کنندگان، بسیار متنوع هستند. تا به امروز بهبود کیفیت به کمک ویرایش ژنوم بر محتوای نشاسته، عطر و طعم، مواد مغذی و کیفیت ذخیره­سازی در گیاهان زراعی تاثیرگذار بوده است. برنج با محتوای آمیلوز پائین که دارای مزه و کیفیت پخت بالاتری است با خاموش کردن ژن WAXY از طریق CRISPR/Cas9 حاصل شده است (22). با استفاده از همین تکنیک و خاموش نمودن ژن WAXY لاین­های با عملکرد بالا در گیاه ذرت تولید شده است (39). از دیگر محصولات با کیفیت ارتقا یافته می­توان به دانه­های Camelina sativa و کلزا که حاوی مقادیر بالای اولوئیک اسید هستند اشاره نمود (15 ،26). گوجه فرنگی­های با عمر انبارداری بالا (17)، دارای لیکوپن بالاتر یا محتوای گاما آمینوبوتریک اسید (17، 29) و همچنین سیب زمینی­های با سطح پائین گلیکوآلکالوئیدهای استروئیدی سمی نیز در این دسته از تغییرات قرار می­گیرند (27).

مقاومت به تنش­های زیستی و غیرزیستی

تنش­ها یکی از مهمترین عوامل تاثیرگذار بر کمیت و کیفیت گیاهان زراعی هستند. تعداد زیادی از گیاهان واجد مقاومت به تنش­های زیستی مانند قارچ­ها، باکتری­ها، ویروس­ها و حشرات به کمک تکنیک کریسپر تولید شده­اند. برای مثال سفیدک پودری یکی از بیماری­های قارچی مخرب در گیاهان زراعی است. با استفاده از TALEN و CRISPR/Cas9 کلیه ۶ آلل TaMLO در گندم خاموش شده و گیاهان با مقاومت بالاتر نسبت به این بیماری بدست آمده اند (43). بطور مشابهی نکراسو و همکاران (۲۰۱۷) نشان دادند خاموشی ژن به کمک CRISPR/Cas9 سبب القا مقاومت به سفیدک پودری در گیاه گوجه­فرنگی شده است (28). بلاست یکی از بیماری­های قارچی مخرب در برنج است. برنج مقاوم به بلاست با خاموش کردن ژن OsERF922 که یک عامل رونویسی پاسخ دهنده به اتیلن است حاصل گردید (41). بلایت باکتریایی در برنج توسط Xanthomonas oryzae pv. Oryzae  ایجاد می­گردد. حذف پیش­بر ژن OsSWEET13 سبب تولید گیاهان مقاوم به این بیماری شده است (51). در مورد بیماری­های ویروسی نیز، با استفاده از تکنیک CRISPR/Cas9 برنج­های eif4g مقاوم به بیماری تونگرو تولید شده است (23).

بهبود صفات

گیاهان زراعی به کمک knock-in و جایگزینی ژنی

بسیاری از صفات زراعی به کمک جایگزینی تک نوکلئوتیدی، تغییرات بیان ژنی و یا اضافه شدن یک عملکرد جدید ژنی تغییر می­یابند. تنظیمات دقیق ژنی مانند knock-in و جایگزینی نوکلئوتیدی سبب تسهیل کار اصلاح از طریق معرفی آلل­های جدید بدون لینکاژ یا ایجاد تنوع آللی می­گردد (شکل ۲- ­ب) که این ویژگی در حالت طبیعی وجود ندارد (21). علاوه بر این knock-in می­تواند در جهت تغییر صفات چندگانه از طریق انباشت ژنی در تک واریته­ها بکار گرفته شود. به همین دلیل knock-in و جایگزینی نوکلئوتیدی در بهبود صفات گیاهان زراعی می­توانند بسیار موثر باشند (شکل ۲- ب). متاسفانه به دلیل نادر بودن مسیر HDR در ترمیم DNA، یک تکنیک غیر معمول بوده و استفاده از آن در بهبود صفات با محدودیت­های جدی روبرو است. با این وجود شی و همکاران (۲۰۱۷) از ویرایش ژنی به کمک CRISPR/Cas9 برای بهبود مقاومت به خشکی در گیاه ذرت بهره بردند (35). ARGOS8 یک تنظیم کننده منفی پاسخ به اتیلن را کد می­کند که در اکثر هیبریدهای ذرت و در سطح کم بیان می­شود. واریته­هایی که در آنها رونویسی این ژن افزایش داده شده بود در شرایط تنش خشکی عملکرد بالاتری تولید نمودند. یو و همکاران (۲۰۱۷) نیز توانستند به کمک ویرایش T317A و جایگزینی در ژن ALC توانستند گوجه فرنگی­هایی با قابلیت حمل و نقل بالا و عمر طولانی تولید نمایند (40).

ویرایش بازها در گیاهان 

همان گونه که بسیاری از صفات مهم زراعی از طریق تنوع موجود در یک نوکلئوتید چه در ناحیه کد کننده یا غیر کدکننده از هم متمایز می­شوند، ویرایش بازی در اصلاح و بهبود گیاهان زراعی می­تواند بسیار مفید واقع شود (شکل ۲- ج). یکی از کاربردهای مهم ویرایش بازی در نواحی کد کننده، توانایی تمایز مقاومت به علفکش­ها است. مقاومت به سولفونیل اوره یا ایمیدیازول در برنج (36)، گندم، آرابیدوپسیس (5) و هندوانه (38) به کمک هدف قرار دادن ALS توسط ویرایش­گر باز سیستیدین بدست آمده است. 

تنظیم دقیق ژنی در گیاهان

در کنار ایجاد جهش در توالی­های حفاظت شده، تعدیل بیان ژن یکی دیگر از دیدگاه­های مفید در بررسی عملکرد ژن بوده و می­تواند اصلاح گیاهان را بطور موثری تسهیل نماید. بیان ژن می­تواند در سطوح مختلفی تنظیم شود، این سطوح شامل رونویسی، سرهم بندی mRNA و ترجمه آن است. این فرآیندها تحت کنترل یکسری از عناصر تنظیمی Cis هستند که به کمک ویرایش ژنوم قابل تنظیم هستند (شکل ۲- د). تا کنون ویرایش ژنوم در گیاهان در جهت تغییر بیان ژنها، عمدتاً روی پیش­برها از قبیل جایگزینی پیش­بر و حذف عناصر تنظیمی Cis تمرکز داشته است.

تولید گیاهان مقاوم به ویروس

بخش بزرگی از بیماری­های گیاهی توسط ویروس­ها ایجاد می­شوند، در نتیجه هرساله بخش قابل توجهی از تولیدات کشاورزی به وسیله این گروه از عوامل بیماری­زا ازدست می­رود. با توجه به اینکه کریسپر توانایی ایجاد مقاومت در باکتری­ها در برابر حمله ویروس­ها را دارد، لذا قطعاً این توانایی را خواهد داشت که گیاهان را به حمله ویروس­ها مقاوم سازد (شکل ۲- ه). برای مثال جیمینی ویروس­ها، جزء ویروس­های با DNA  تک رشته­ای هستند که یک بخش دو رشته­ای ضروری جهت همانندسازی به روش دایره غلتان دارند. استراتژی بیش­بیان پایدار Cas9 و sgRNA که بطور ویژه ژنوم جیمینی ویروس­ها را هدف قرار می­دهد تا همانند­سازی آنها را مهار کند، برای اصلاح گیاهان مقاوم به ویروس بکار گرفته شده است (2). با این حال تغییرات ایجاد شده در جایگاه­های برش دو رشته­ای توسط مسیر ترمیمی NHJE، این امکان را فراهم می­سازد که فرم­هایی از ویروس بتوانند از برش Cas9/gRNA فرار کنند (24). از آنجا که توالی ساقه-حلقه درونی برای همانند­سازی جیمینی ویروس­ها ضروری است، لذا این توالی­ها بعنوان هدف­های ایدئال برای تولید گیاهان مقاوم به جیمینی ویروس­ها بشمار می­روند (1).

ایجاد کتابخانه­های موتانتی با کارایی بالا در گیاهان

کتابخانه­های موتانتی در برگیرنده یک ژنوم کامل می­تواند کاربردهای گسترده و ارزشمندی در ژنومیکس کارکردی و پیشبرد علم ژنتیک داشته باشند (شکل ۲- و). کتابخانه­های موتانتی قدیمی مبتنی بر ایجاد جهش­های تصادفی به کمک عواملی مانند اشعه­ها، جایگزینی T-DNA، EMS و ترانسپوزون­ها می­باشند. استفاده از این روش­ها نیازمند ایجاد تعداد زیادی نسل جهت پایداری موتانت­های غیرفعال است و تعیین ارتباط بین فنوتیپ و ژنوتیپ در بین این موتانت­ها فرآیندی بسیار زمانبر است. برای مثال کتابخانه موتانتی حاصل از دو کانسترکت بزرگ تولید شده به کمک کریسپر می­تواند بیشتر ژن­های گیاه برنج را پوشش دهد. به کمک این روش موتانت­های هموزیگوت نیز در یک نسل قابل تولید هستند.

نتیجه­گیری

ویرایش ژنوم بطور عام و CRISPR/Cas9 بطور خاص، ابزارهای قدرتمندی هستند که می­توانند تحولی بزرگ در تولیدات کشاورزی و امنیت غذایی ایجاد نمایند. فناوری CRISPR/Cas9 این پتانسیل را دارد که کشاورزی را از طریق تولید گیاهان مقاوم به تنش­های زیستی و غیرزیستی و ارتقاء عملکرد کمی و کیفی آنها دگرگون سازد. این ویژگی­ها برای تامین امنیت غذایی جمعیت در حال رشد دنیا لازم و ضروری هستند. به کمک این روش دانشمندان توانستند با بالاترین دقت و در کمترین زمان صفات مورد نظر را در گیاهان ایجاد نمایند. با وجودی که این روش در مدت کوتاهی توانسته تغییرات بزرگی در گیاهان ایجاد نماید، کاربرد این روش نیازمند اطلاعات دقیق از توالی ژنهای هدف و همچنین بهبود کارایی این قیچی مولکولی در جهت کاهش اثرات غیر هدفمند و سمی آن است. دانشمندان بسیار امیدوارند این فناوری بتواند نگرانی­های عامه در مورد گیاهان تراریخته را برطرف نماید. 

 

 

  1. gene-targeting
  2. vector
  3. 1. Nock-out
  1. Ali Z, Ali S, Tashkandi M, Zaidi SS, Mahfouz MM. 2016. CRISPR/Cas9-mediated immunity to geminiviruses: differential interference and evasion. Sci. Rep. 6:26912.
  2. Baltes NJ, Hummel AW, Konecna E, Cegan R, Bruns AN, et al. 2015. Conferring resistance to geminiviruses with the CRISPR–Cas prokaryotic immune system. Nat. Plants 1:15145.
  3. Butt H, Eid A, Ali Z, Atia MAM, Mokhtar MM, et al. 2017. Efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing using a chimeric single-guide RNA molecule. Front. Plant Sci. 8:1441.
  4. Cermak T, Baltes NJ,Cegan R, Zhang Y, Voytas DF. 2015. High-frequency, precise modification of the tomato genome. Genome Biol. 16:232.
  5. Chen K, Wang Y, Zhang R, Zhang H, Gao C. 2019. CRISPR/Cas Genome Editing and Precision Plant Breeding in Agriculture. Annu. Rev. Plant Biol. 2019. 70:28.1–28.31.
  6. Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, et al. 2010. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186:757–61.
  7. Dreissig S, Schiml S, Schindele P,Weiss O, Rutten T, et al. 2017. Live-cell CRISPR imaging in plants reveals dynamic telomere movements. Plant J. 91:565–73.
  8. FAOSTAT. FAOSTAT Database. 2016. Available at: http://faostat3.fao.org/ faostatgateway/ go/to/download/Q/QC/E.
  9. Fonfara, I., Le Rhun, A., Chylinski, K., Makarova, K.S., Lecrivain, A.L., Bzdrenga, J., et al. 2014. Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 42, 2577–2590.
  10. Gallego-Bartolome J, Gardiner J, Liu W, Papikian A, Ghoshal B, et al. 2018. Targeted DNA demethylation of the Arabidopsis genome using the human TET1 catalytic domain. PNAS 115:E2125–34.
  11. Gao Y, Zhao Y. 2013. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. J. Integr. Plant Biol. 56:343–49.
  12. He Y, Zhu M,Wang L,Wu J,Wang Q, et al. 2018. Programmed self-elimination of the CRISPR/Cas9 construct greatly accelerates the isolation of edited and transgene-free rice plants. Mol. Plant 11:P1210– 13.
  13. Hess GT,Tycko J,Yao D, Bassik MC. 2017. Methods and applications of CRISPR-mediated base editing in eukaryotic genomes. Mol. Cell 68:26–43.
  14. Ji X, Si X, Zhang Y, Zhang H, Zhang F, et al. 2018. ConferringDNAvirus resistance with high specificity in plants using a virus-inducible genome editing system. Genome Biol. 19:197.
  15. Jiang WZ, Henry IM, Lynagh PG, Comai L, Cahoon EB,Weeks DP. 2017. Significant enhancement of fatty acid composition in seeds of the allohexaploid, Camelina sativa, using CRISPR/Cas9 gene editing. Plant Biotechnol. J. 15:648–57.
  16. Kungulovski G, Jeltsch A. 2016. Epigenome editing: state of the art, concepts, and perspectives. Trends Genet. 32:101–13.
  17. Li J, Zhang H, Si X, Tian Y, Chen K, et al. 2017. Generation of thermosensitive male-sterile maize by targeted knockout of the ZmTMS5 gene. J. Genet. Genom. 44:465–68.
  18. Liang Z, Chen K, Li T, Zhang Y, Wang Y, et al. 2017. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nat. Commun. 8:14261.
  19. Liang, Z., Chen, K., Li, T., Zhang, Y., Wang, Y., Zhao, Q., et al. 2017. Efficient DNA-free genome editing of bread. 23: 233.
  20. Lowder LG, Zhang D, Baltes NJ, Paul JW,Tang X, et al. 2015. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation. Plant Physiol. 169:971–85.
  21. Luo M, Gilbert B, Ayliffe M. 2016. Applications of CRISPR/Cas9 technology for targeted mutagenesis, gene replacement and stacking of genes in higher plants. Plant Cell Rep. 35:1439–50.
  22. Ma Y, Zhang J, Yin W, Zhang Z, Song Y, Chang X. 2016. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat. Methods 13:1029.
  23. Macovei A, Sevilla NR, Cantos C, Jonson GB, Slamet-Loedin I, et al. 2018. Novel alleles of rice eIF4G generated by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis confer resistance to Rice tungro spherical virus. Plant Biotechnol. J. 16:1918–27.
  24. Mehta D, Sturchler A, Hirsch-Hoffmann M, Gruissem W, Vanderschuren H. 2018. CRISPR-Cas9 interference in cassava linked to the evolution of editing-resistant geminiviruses. bioRxiv 314542.
  25. Mohanraju, P., Makarova, K.S., Zetsche, B., Zhang, F., Koonin, E.V., van der Oost, J. 2016. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science 353, aad5147.
  26. Morineau C, Bellec Y, Tellier F, Gissot L, Kelemen Z, et al. 2017. Selective gene dosage by CRISPRCas9 genome editing in hexaploid Camelina sativa. Plant Biotechnol. J. 15:729–39.
  27. Nakayasu M, Akiyama R, Lee HJ, Osakabe K, Osakabe Y, et al. 2018. Generation of α-solanine-free hairy roots of potato by CRISPR/Cas9 mediated genome editing of the St16DOX gene. Plant Physiol. Biochem. 131:70–77.
  28. Nekrasov V,Wang C,Win J, Lanz C,Weigel D, Kamoun S. 2017. Rapid generation of a transgene-free powdery mildew resistant tomato by genome deletion. Sci. Rep. 7:482.
  29. Nonaka S, Arai C,Takayama M, Matsukura C, Ezura H. 2017. Efficient increase of γ-aminobutyric acid (GABA) content in tomato fruits by targeted mutagenesis. Sci Rep. 7:7057.
  30. Pacher M, Puchta H. 2017. From classical mutagenesis to nuclease-based breeding-directing natural DNA repair for a natural end-product. Plant J. 90:819–33.
  31. Prado JR, Segers G, Voelker T, Carson D, Dobert R, et al. 2014. Genetically engineered crops: from idea to product. Annu. Rev. Plant Biol. 65:769–90.
  32. Salsman J, Dellaire G. 2016. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochem. Cell Biol. 95:187–201.
  33. Sato, H., Yamada, T., Kita, Y., Ishimoto, M., Kitamura, K.. 2007. Production of transgenic plants and their early seed set in Japanese soybean variety, Kariyutaka. Plant Biotechnol. 24, 533–536.
  34. Scheben A, Wolter F, Batley J, Puchta H, Edwards D. 2017. Towards CRISPR/Cas crops—bringing together genomics and genome editing. New Phytol. 216:682–98.
  35. Shi J, Gao H,Wang H, Lafitte HR, Archibald RL, et al. 2017. ARGOS8 variants generated by CRISPRCas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions. Plant Biotechnol. J. 15:207– 16.
  36. Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, Terada R, Arazoe T, et al. 2017. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat. Biotechnol. 35:441–43.
  37. Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, Terada R, Arazoe T, et al. 2017. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat. Biotechnol. 35:441–43.
  38. Tian S, Jiang L, Cui X, Zhang J, Guo S, et al. 2018. Engineering herbicide-resistant watermelon variety through CRISPR/Cas9-mediated base-editing. Plant Cell Rep. 37:1353–56.
  39. Waltz E. 2016. CRISPR-edited crops free to enter market, skip regulation. Nat. Biotechnol. 34:582.
  40. Wang FZ, Chen MX, Yu LJ, Xie LJ, Yuan LB, et al. 2017. OsARM1, an R2R3 MYB transcription factor, is involved in regulation of the response to arsenic stress in rice. Front. Plant Sci. 8:1868.
  41. Wang M, Lu Y, Botella JR, Mao Y, Hua K, Zhu JK. 2017. Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system. Mol. Plant 10:1007–10.
  42. Wang X, Li J,Wang Y, Yang B,Wei J, et al. 2018. Efficient base editing in methylated regions with a human APOBEC3A-Cas9 fusion. Nat. Biotechnol. 36:946–49.
  43. Wang Y, Cheng X, Shan Q, Zhang Y, Liu J, et al. 2014. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 32:947–51.
  44. Woo, J.W., Kim, J., Kwon, S.I., Corvalan, C., Cho, S.W., Kim, H., et al. 2015. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nat. Biotechnol. 33, 1162–1164.
  45. Wright DA,Townsend JA,WinfreyRJ Jr., Irwin PA, Rajagopal J, et al. 2005. High-frequency homologous recombination in plants mediated by zinc-finger nucleases. Plant J. 44:693–705.
  46. Xie Y, Niu B, Long Y, Li G, Tang J, et al. 2017. Suppression or knockout of SaF/SaM overcomes the Sa-mediated hybrid male sterility in rice. J. Integr. Plant Biol. 59:669–79.
  47. Xu, R., Yang, Y., Qin, R., Li, H., Qiu, C., Li, L., ... & Yang, J. 2016. Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics= Yi chuan xue bao, 43(8), 529-532.
  48. Yang, H., Shivalila, C. S., Dawlaty, M. M., Cheng, A. W., Zhang, F., & Jaenisch, R. 2013. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. cell, 153(4), 910-918.
  49. Yu QH,Wang B, Li N, Tang Y, Yang S, et al. 2017. CRISPR/Cas9-induced targeted mutagenesis and gene replacement to generate long-shelf life tomato lines. Sci. Rep. 7:11874.
  50. Yu X, Zhao Z, Zheng X, Zhou J, Kong W, et al. 2018. A selfish genetic element confers non-Mendelian inheritance in rice. Science 360:1130–32.
  51. Zhou H, He M, Li J, Chen L, Huang Z, et al. 2016. Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system. Sci. Rep. 6:373.95.

  • تاریخ دریافت 11 خرداد 1401
  • تاریخ بازنگری 06 مرداد 1401
  • تاریخ پذیرش 11 اردیبهشت 1403