مروری بر بیهوشی و تزریقات در موش آزمایشگاهی

روزبه فلاحی^*

کرج، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی

* نویسنده مسئول،  پست الکترونیکی: fallahiroozbeh@gmail.com

چکیده

در تحقیقات علمی، موش آزمایشگاهی از جایگاه ویژه­ای برخوردار است و به عنوان اولین حیوان انتخابی مطرح است. موش­های آزمایشگاهی در مطالعات و تحقیقات بیولوژی، باکتریولوژی، ویرولوژی، فارماکولوژی، فیزیولوژی بیماریها، سلول و  سرطان­شناسی، تغذیه، ژنتیک، تهیه سرم و واکسن، تست فرآورده­های بیولوژیک، تست فرآورده­های دارویی، مطالعات روان­شناسی، آزمایشات رفتاری، تست ناهنجاری­زایی، تست­های سم­شناسی، تست مکمل­های غذایی، تحقیقات فضایی، ایزوتوپ­ها و مواد رادیو اکتیو و بسیاری از موضوعات دیگر مورد استفاده قرار می­گیرند. از آنجاکه در بسیاری از آزمایشاتی که بر روی موش های آزمایشگاهی انجام می گیرند، نیاز به بیهوش کردن آنها جهت انواع روش های تزریقات، خونگیری ها، جراحی و ... است، لذا  لزوم به کارگیری و استفاده از داروهای مناسب بیهوشی و طریقه استفاده از آنها و معرفی انواع روش های استاندارد تزریقات در این حیوان آزمایشگاهی ضروری به نظر می رسد.

کلیدواژگان: بیهوشی، تزریقات، موش آزمایشگاهی

مقدمه

حیوانات آزمایشگاهی در زمینه­های مختلف کاربرد داشته و اکنون سالیانه، میلیون­ها سر از این حیوانات در تحقیقات گوناگون نظیر بیولوژی، ایمنی­شناسی، انگل­شناسی، پاتوفیزیولوژی، سرطان، ژنتیک، اختلالات ارثی، تغذیه، بیماری­های عفونی، جراحی تجربی، رادیولوژی، پیوند اعضاء، تعیین اثر داروهای جدید و حتی در کیهان­نوردی و تحقیقات فضایی استفاده می­شوند. به طور کلی از حیوانات آزمایشگاهی به عنوان مدل، در تحقیقات زیست شناسی استفاده می­شود. گرچه از  هر حیوانی، چه اهلی و غیر اهلی در زمینه­های مختلف می­توان استفاده کرد، ولی جوندگان و حیوانات کوچکتر به لحاظ اندازه کوچک و مناسب،  قابلیت تولید مثل بالا،  تعدد انواع،  دستیابی آسان، راحتی کار و احتیاج به فضای کمتر، به مقدار بیشتری نسبت به حیوانات دیگر مورد استفاده قرار می­گیرند. ­موش به تنهایی در حدود 80 %  ­از کل حیوانات آزمایشگاهی مورد استفاده در تحقیقات را به خود اختصاص می­دهد. سالیانه میلیون ها سر موش آزمایشگاهی در تحقیقات گوناگون به مصرف می­رسد. در کار عملی بر روی حیوانات آزمایشگاهی نظیر انجام روش های مختلف تزریقات، خونگیری ها، جراحی و ...  نیاز به بیهوش کردن آنها با استفاده از داروهای مناسب بیهوشی می باشد.  انتخاب و طریقه استفاده از انواع داروها و معرفی انواع روش های استاندارد تزریقات، بر طبق رعایت موارد اصول اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی از اهمیت زیادی برخوردار می باشد (6-1).

ایجاد بیهوشی در موش آزمایشگاهی

 بیهوشی به دو صورت استنشاقی (استفاده از مایعات فرار بیهوش کننده) و تزریقی صورت می­گیرد. در روش استنشاقی، استفاده از هالوتان، متوکسی فلوران، ایزو فلوران، اتر و کلروفرم در محفظه­های شیشه ای و استفاده از آتروپین برای جلوگیری از ترشح بزاق دهان و گرفتگی عضلات معمول است (شکل 1). در بعضی از نژادها بویژه در نرها، کلروفرم آسیب شدید کبدی و کلیوی ایجاد می­کند. برای بی­حسی­های موضعی از ژل­ها و اسپری­ها یا کرم­های بی­حسی لیدوکائین و پروکائین[1]  و بوپیواکائین[2] در محل تزریق استفاده می­شود. برای بیهوشی تزریقی، بسته به مدت زمان مورد نیاز بیهوشی، از دیازپام (5 میلی­گرم به ازاء هر کیلوگرم)، پنتوباربیتال (60-50 میلی­گرم به ازاء هر کیلوگرم)، کتامین هیدروکلراید (75 میلی­گرم به ازاء هر کیلوگرم) همراه با زایلازین (با نام تجارتی رامپون) (10-5 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم) که همگی به صورت داخل صفاقی تجویز می‌شوند استفاده می­گردد و مدت زمان بیهوشی بین 20 تا 60 دقیقه است. در بعضی از منابع مانند کتاب UFAW[3]، دز⁴ کتامین، 100- 80  میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم + زایلازین به مقدار، 10 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم به صورت داخل صفاقی و مدت زمان بیهوشی 30-20 دقیقه  ذکر شده است (1، 4، 6، 7، 8).

شکل 1- بیهوشی استنشاقی در موش آزمایشگاهی.

نکات مهم:

1- قبل از تزریق هر دارو، باید حیوان لحظاتی در محیط آزمایشگاه قرار بگیرد تا دمای آن با دمای محیط یکسان شود.

2- موضع تزریق با پنبه آغشته به الکل 70% ضد عفونی شود.

3- جهت پیشگیری از صدمات بافتی به حیوان، همواره از سرنگ مناسب و یکبار مصرف و سوزن با نمره مورد نظر استفاده شود.

کتامین

برای اولین بار در سال 1970 در گربه استفاده شد. کتامین با جلوگیری از اثر انتقال دهنده عصبی تحریکی گلوتامیت[4] بر گیرنده­های ان- متیل- دی-آسپارتیت[5] اثر بیهوش کنندگی خود را اعمال می­کند. در صورت مصرف آن به تنهایی، احتمال بروز تشنج و صرع، وجود دارد. به همین دلیل معمولاً به صورت ترکیب با دیگر داروهای تضعیف کننده سیستم اعصاب مرکزی به کار برده­ می­شود.کتامین با تحریک اعصاب سمپاتیک، به افزایش ضربان قلب، فشار خون و برون ده قلبی منجر می­شود. کتامین بر خلاف دیگر داروهای بیهوشی، نه تنها شلی عضلانی ایجاد نمی­کند، بلکه توان عضلانی را افزایش می دهد. بی­دردی ناشی از کتامین برای جلوگیری از درد­های احشایی موثر نیست، اما برای تسکین دردهای سطحی، مانند سوختگی، بسیار موثر است. این دارو از جفت می­گذرد و می‌تواند جنین را تضعیف کند. در بیهوشی با کتامین، چشم­ها باز باقی می ماند، لذا استفاده از محلول­های چشمی، برای جلوگیری از خشک شدن سطح قرنیه، ضروری است (1، 4، 6، 8، 9).

زایلازین

زایلازین (رامپون) با تحریک گیرنده­های آلفا 2 آدرنرژیک[6] درسیستم اعصاب مرکزی و به دنبال آن کاهش میزان آزاد شدن نور اپی­نفرین⁵ در اعصاب، به ایجاد آرام بخشی و بروز خواب آلودگی می­انجامد. دیگر اثرهای این دارو، شامل شلی عضلانی، بی­دردی و استفراغ در گوشتخواران است. این دارو به وسیله کبد متابولیزه و از راه ادرار دفع می­شود (1، 4، 6، 8، 9).

تزریقات در موش آزمایشگاهی

روش­های مختلف تزریق در موش آزمایشگاهی عبارت اند از:

تزریق داخل عضلانی (IM)⁶

پس از مقید کردن حیوان، تزریق در عضله خلفی ران⁷ صورت می­گیرد. مقدار ماده تزریقی 2/0-1/0 میلی­لیتر و نمره مناسب  سوزن،­ 25-23 می­باشد (شکل 2) (1، 4، 6، 7).

تزریق داخل صفاقی (IP)⁸

پس از مقید نمودن موش به طوری که شکم حیوان بطرف تزریق کننده و نیز سر حیوان بطرف پایین قرار گیرد، تزریق داخل صفاقی صورت می­گیرد. در این صورت امعاء و احشا بطرف دیافراگم رانده شده و از ناحیه تزریق دور می­شوند. محل تزریق، در طرفین شکم و ترجیحاً طرف چپ و قسمت پایین شکم است که پس از ضدعفونی کردن با الکل­70 % و آسپیره کردن، ماده مورد نظر را باید به آرامی تزریق کرد (شکل­ 3). مقدار ماده مورد نظر 5/1-1 میلی­لیتر و سوزن­ نمره 23، مناسب می­باشد. نحوه و میزان تزریق و استفاده از نمره مناسب سوزن بایستی به دقت رعایت شود. در غیر این صورت صدمات و آسیب­های بافتی در محل تزریق ایجاد می­شود که ممکن است در نتیجه تحقیق تأثیر­گذار باشد (شکل 4).

شکل 2- موقعیت آناتومیکی عضله خلفی ران و تزریق در آن. 

شکل 3- تزریق داخل صفاقی در موش آزمایشگاهی.

اگر در هنگام آسپیره کردن، ماده زرد رنگ دیده شود نشان دهنده، وارد شدن سوزن به مثانه و اگر ماده سبز و یا قهوه­ای رنگ دیده شود نشان­دهنده وارد شدن سوزن به روده­ها می‍باشد که در این صورت سرنگ و سوزن را باید عوض کرده، حتی­الامکان حیوان نیز تعویض شود (1، 3، 4، 6، 7، 10).

تزریق داخل وریدی (IV)[7]

در این حالت بهتر است حیوان در حالت بیهوشی باشد. پس از ضد­عفونی­کردن دم حیوان، تزریق در داخل ورید دم صورت می­گیرد. مقدار ماده مورد نظر 5/0-2/0 میلی­لیتر و نمره مناسب سوزن، 29-27 می­باشد. در صورت تزریق نادرست، محل تزریق متورم و پیستون در سیلندر سرنگ به سختی حرکت می­کند. در صورت درستی کار، ماده مورد نظر براحتی در رگ دم به جریان می­افتد (شکل 5). از ورید صافن جانبی[8] نیز می­توان برای تزریق داخل وریدی استفاده کرد (شکل 6) (1، 4، 6، 7، 11).

تزریق زیرجلدی (SC)[9]

حیوان را به روی شکم قرار داده و پس از ضد عفونی کردن محل تزریق، پوست پشت گردن را بلند کرده و تزریق را انجام می­دهیم (شکل 7). مقدار ماده تزریقی 2/0 میلی­لیتر و سوزن نمره 22، توصیه ­می­شود (1، 4، 6، 7).

تزریق داخل پوستی ([10]ID)

پس از چیدن موی قسمت گردن و یا کمر حیوان، محل تزریق را با پنبه الکل ضد عفونی کرده، سوزن را به صورت مماس با بدن در بین جلد فرو می­بریم. مقدار ماده مورد نظر 1/0 میلی­لیتر و نمره سوزن مناسب، 29-27 می­باشد. در صورت درستی عمل، محل تزریق به اندازه یک عدس متورم می­شود (شکل 8) (1، 4، 6، 7).

تزریق داخل ­مغزی[11]

جهت عبور مواد شیمیایی یا دارویی از سد خونی- مغزی[12] و رساندن مستقیم آنها به سیستم اعصاب مرکزی، از روش تزریق داخل­مغزی استفاده می­شود. این روش بیشتر در موش، رت و جوجه مورد استفاده قرار می­گیرد. در موش و رت در­ نوزادان زیر 3 روز صورت می­گیرد.

شکل 4- محل تزریق داخل صفاقی (شکل سمت راست، در حالت طبیعی و قبل از تزریق، شکل وسط هیپرپلازی خفیف سلول­های آماسی در محل تزریق در روش تزریق مناسب، شکل سمت راست،  هیپرپلازی شدید سلول­های آماسی در محل تزریق در روش تزریق نامناسب).

شکل 5- تزریق داخل ورید دم موش آزمایشگاهی.

شکل 6 - موقعیت آناتومیکی ورید صافن جانبی موش آزمایشگاهی.

شکل 7- تزریق زیر­جلدی در موش آزمایشگاهی.

برای انجام این تزریق، سر نوزاد را بین دو انگشت شست و نشانه قرار داده، سوزن با نمره 27 را با زاویه 45 درجه از سمت جلو در منطقه جلویی ملاج [13]وارد مغز می­کنیم. مقدار تزریق نباید بیشتر از 5/0 میلی­لیتر­ باشد. بعد از تزریق، ­نوزاد را به پیش مادر برده و تا یک ساعت باید تحت نظر قرار گیرد. بعضی اوقات مادر آن را قبول نمی­کند و آن را از خود دور می­کند. اگر از محل تزریق، خون آمده باشد، مادر ممکن است نوزاد را کشته، آن را  بخورد. بهتر است برای جلوگیری از صدمات احتمالی و استرس زیاد، قبل از تزریق، نوزاد را بیهوش کرد. برای تزریق به بالغین، به یک فریم جامد با گیره مخصوص نیاز است که سر حیوان در آن قرار می­گیرد و کاملاً بی­حرکت می­شود (شکل 9). گرچه می­توان بدون فریم نیز تزریق را انجام داد (شکل 10)، بیهوشی نیز لازم می­باشد.

شکل 8- تزریق داخل پوستی در موش آزمایشگاهی.

شکل 9- تزریق داخل مغزی در موش آزمایشگاهی بالغ، با استفاده از فریم.

شکل 10- تزریق داخل­مغزی در موش آزمایشگاهی بالغ، بدون استفاده از فریم.

حجم تزریق نباید بیشتر از 2 % حجم مغز باشد. تزریق باید به آرامی صورت گیرد (1، 4، 6، 7).

در نوزادان، تزریق در منطقه تالامیک[14] نیمکره­های مغزی صورت می­گیرد. خطوط زیگزاگ اتصال بین استخوانی در زیر پوست مشخص می­باشند (شکل 11، ­A). خطوط زیگزاگ میانی و افقی را مشخص نموده و نقطه تزریق را که در حد واسط آنها می­باشد علامت­گذاری کرده و سوزن را وارد می­کنیم (شکل 11 ،A  و B) (1،  7). می‌توان برای مشخص کردن نقطه تزریق، از محل تلاقی خطوط زیگزاگ میانی و کورونال[15] نیز استفاده نمود که به این محل برگما[16] می­گویند. پس از تعیین نقطه برگما، مناسب ترین نقطه تزریق، 1 میلی­متر در قسمت خلفی و 2 میلی­متر در قسمت جانبی آن می­باشد (در شکل 12 با علامت + مشخص شده است) (1،  7). عمق فرو بردن سوزن در مغز نباید از 5/1 میلی­متر بیشتر باشد. در غیر این صورت صدمات وارده بسیار بیشتر می­باشد. می‌توان با یک تکه فوم (یونولیت)­ که بر روی سوزن نصب می­شود، اندازه 5/1­ میلی­متر را برای سوزن ثابت و تنظیم کرد (شکل 13) (1،  7).

تزریق داخل بالشتک کف پا[17] و قاعده دم

جهت جذب آهسته بعضی از آنتی ژن­ها، تزریق در داخل بالشتک کف پا و یا در قاعده دم صورت می­گیرد. در جوندگان برای مدل آزمایشگاهی آرتریت موضعی یا عمومی، تزریق ادجوانت کامل فروند[18] در داخل بالشتک کف پا و یا در قاعده دم صورت می­گیرد (شکل­های 14 و 15). حیوان مبتلا به آرتریت بایستی در بستری نرم قرار گیرد و آب و غذای آن در داخل قفس و جلوی حیوان ریخته شود تا مجبور به حرکت نباشد (1،  4،  5،  11). باید توجه داشت که در تمام این تزریقات، بهتر است که حیوان بیهوش باشد و آسپیره کردن قبل از تزریق ضروری است (1، 4، 6، 7).

شکل 11- محل تزریق داخل­مغزی در نوزاد موش آزمایشگاهی.

     شکل 12- محل تزریق داخل­مغزی در نوزاد موش آزمایشگاهی.

شکل 13- تنظیم میزان عمق تزریق سوزن با استفاده از یونولیت.

شکل 14- شکل سمت راست:آرتریت ایجاد شده در بالشتک کف­پای موش آزمایشگاهی شکل سمت چپ: حالت طبیعی.

شکل 15- تزریق در قاعده دم موش آزمایشگاهی.

[1] Procaine

[2] Bupivacaine          

[3] Universities Federation for Animal Welfare                                                                                                                                                              ⁵ Norepinephrine

[4] Glutamate                                                                                                                                                                                                                                                                                                              ⁶ Intramuscular injection

[5] N-Methyl-D-Aspartate                                                                                                                                                                                                                                                            ⁷ Caudal thigh muscle

[6] α₂ adrenergic                                                                                                                                                                                                                                                                                          ⁸ Intraperitoneal injection

[7] Intravenous injection

[8] Lateral saphenous vein

[9] Subcutaneous injection

[10] Intradermal injection

[11] Intracranial injection

[12] Blood-Brain Barrier

[13] Fontanelle

[14] Thalamic

[15] Coronal

[16] Bregma

[17] Footpad

[18] Freund’s Complete Adjuant